Klonierung und Expression

Proteinexpressionsvektoren

Plasmide, auch Proteinexpressionsvektoren genannt, sind ringförmige DNA-Stücke, die zahlreiche funktionelle Elemente für die Klonierung und Expression des gewünschten Proteins enthalten. Die Auswahl des geeigneten Expressionsvektors hängt unter anderem von der Art des Proteins, dem Organismus, in dem das Protein exprimiert werden soll, sowie von der spezifischen Anwendung und den wissenschaftlichen Fragestellungen ab, mit denen sich der Forscher befassen möchte. Die große Vielfalt an verfügbaren Expressionsvektoren ermöglicht es Forschern, die für ihre Studie am besten geeigneten Elemente für die Klonierung, Klonselektion und Proteinexpression auszuwählen. Sobald die gewünschte Gensequenz und der Expressionsvektor ausgewählt sind, verwenden Forscher üblicherweise Nukleasen, um den Vektor an bestimmten Stellen präzise zu spalten, damit die gewünschte Gensequenz in-frame kloniert und schließlich in einem Wirtsorganismus exprimiert werden kann. Wichtig ist, dass Forscher üblicherweise chemisch kompetente Zellen und bakterielle Transformation nutzen, um die rekombinanten DNA-Plasmide zu beherbergen, da diese bei einer Lagerung bei -70 °C stabil sind.

Wie man Zellen transfiziert

Unter Zelltransfektion versteht man den Vorgang, bei dem DNA, RNA oder Proteine in eukaryotische Zellen eingebracht werden. Forschern stehen eine Vielzahl physikalischer, chemischer und biologischer Verfahren zur Verfügung, um diesen Teil des Arbeitsablaufs zur Proteinexpression durchzuführen. Physikalische Methoden wie die Elektroporation oder chemische Methoden, darunter Calciumphosphat (CaPi), Polyethylenimin (PEI) und Lipofektionsreagenzien, werden von Forschern häufig eingesetzt. Wissenschaftlern stehen zudem virale Transduktionssysteme zur Verfügung, darunter lentivirale, onkoretrovirale und adenovirale Systeme. Der Einsatz viraler Verabreichungsmethoden erfordert jedoch aus Gründen der Biosicherheit oft zusätzliche Sicherheitsvorkehrungen und Überwachungsmaßnahmen.

Proteinexpressionssysteme

Forscher nutzen verschiedene Organismen, um das Protein von Interesse zu exprimieren. Bakterien werden häufig eingesetzt, da sie Expressionsvektoren effizient aufnehmen, schnelle Verdopplungszeiten aufweisen und unter optimalen Bedingungen große Mengen an rekombinantem Protein produzieren können. Da Bakterien jedoch prokaryotische Organismen sind, sind sie nicht in der Lage, die für manche Proteine erforderlichen posttranslationalen Modifikationen durchzuführen. Eukaryotische Zellen, darunter Hefe- und Säugetierzelllinien, ermöglichen posttranslationale Modifikationen von Proteinen und werden ebenfalls häufig von Forschern eingesetzt. Die Wahl der besten Zelllinie für die Expression rekombinanter Proteine sowie die Strategie der Proteinexpression hängen in hohem Maße von den spezifischen Anwendungsanforderungen und den Fragestellungen ab, die der Wissenschaftler untersuchen möchte.