Standard PCR-Protokoll

Wie man eine PCR durchführt

Ein Standardaufbau einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) besteht aus vier Schritten:

1. Die erforderlichen Reagenzien oder Mastermix und Template in PCR-Gefäße geben.
2. Mischen und zentrifugieren.
   *Mineralöl hinzufügen, um Verdunstung in einem Thermocycler ohne beheizten Deckel zu verhindern.
3. Amplifizieren gemäß Thermocycler- und Primer-Parametern.
4. Auswerten der amplifizierten DNA durch Agarosegel-Elektrophorese und anschließende Ethidiumbromid-Färbung.

Diese Schritte werden im Folgenden zusammen mit Tipps zur Auswahl von Materialien und Reagenzien ausführlicher dargestellt. Dies ist ein grundlegendes PCR-Protokoll unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase.

PCR-Schritte und wesentliche PCR-Komponenten

Bei der Fehlersuche in einer PCR-Reaktion spielen viele Faktoren eine Rolle. Sehen Sie sich diese Animation an, um zu erfahren, wie die Auswahl der richtigen Komponenten und Zyklusbedingungen für Ihre Bedürfnisse zu optimalen Ergebnissen führen kann.

Weitere Protokolle für andere Polymerasen oder fortgeschrittene PCR-Techniken finden Sie im Protokolle unseres Leitfadens PCR-Technologien.

Erfahren Sie mehr über die Standard-PCR, unter anderem was sie ist, auf unserer PCR-Grundlagen-Seite.

Reagenzien: Was wird für die PCR benötigt?

Was ist Taq Polymerase?

Taq DNA-Polymerase ist ein thermostabiles Enzym, das aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammt. Es wird üblicherweise zur Amplifikation von DNA-Fragmenten in der PCR verwendet. Das Enzym liegt in einer rekombinanten Form vor, die in E. coli exprimiert wird. Es ist in der Lage, wiederholtes Erhitzen auf 95 °C (wie es bei der PCR-Technik erforderlich ist) ohne nennenswerten Aktivitätsverlust zu überstehen. Das Enzym hat ein Molekulargewicht von ca. 94 kDa (SDS-PAGE) und weist keine nachweisbare Endonuklease- oder Exonuklease-Aktivität auf. Es besitzt 5'→3' DNA-Polymerase-Aktivität und 5'→3' Exonuklease-Aktivität. Jede Charge von Taq DNA-Polymerase wird für die PCR-Amplifikation und die doppelsträngige Sequenzierung getestet. Das Enzym wird in 5 Einheiten/µL geliefert und wird mit einem optimierten 10x Reaktionspuffer geliefert.

Standard Taq DNA-Polymerase

Nutzen Sie die folgende Tabelle, um eine geeignete Mischung von Taq DNA-Polymerase für Ihre Reaktionsbedingungen auszuwählen. Wählen Sie aus klaren oder rot gefärbten Formulierungen mit und ohne Magnesiumchlorid (MgCl₂) oder einem vorgefertigten Readymix oder Master-Mix mit Puffer und dNTPs.

Einheitsdefinition: Eine Einheit baut 10 nmol der gesamten Desoxyribonukleosidtriphosphate in 30 Minuten bei 74 °C in säurefällbare DNA ein.

Ablauf: Schritte der PCR

Die optimalen Bedingungen für die Konzentration von Taq-DNA-Polymerase, Template-DNA, Primern und MgCl₂ hängen von dem verwendeten System ab. Es kann notwendig sein, die optimalen Bedingungen für jede einzelne Komponente zu bestimmen. Dies gilt insbesondere für die Taq-DNA-Polymerase, die Zyklusparameter und die MgCl₂-Konzentration. Es wird empfohlen, das Enzym und die MgCl₂-Konzentration zu titrieren, um die optimale Effizienz zu bestimmen.

1. Geben Sie die Reagenzien in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge in ein Röhrchen geeigneter Größe. (Wählen Sie die entsprechende Tabelle für den Reaktionsaufbau: Standard- oder Fertigmischungsreagenz.) Für eine große Anzahl von Reaktionen sollte eine Mastermischung ohne das Template erstellt und in Reaktionsröhrchen aliquotiert werden. Am Ende sollte die Vorlage in die entsprechenden Gefäße gegeben werden.
   

Standard PCR-Reaktion

*Puffer und Taq Polymerase zusammen kaufen: D1806, D4309 oder D4545

Readymix PCR-Reaktion

2. Mixen Sie vorsichtig mit dem Vortex und zentrifugieren Sie kurz, um alle Komponenten am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Hinweis: Geben Sie 50 µL Mineralöl oben auf jedes Röhrchen, um die Verdunstung zu verhindern, wenn Sie einen Thermocycler ohne beheizten Deckel verwenden.

3. Amplifizieren. Die Amplifikationsparameter hängen von den verwendeten Primern und dem Thermocycler ab. Es kann notwendig sein, das System für einzelne Primer, Templates und Thermocycler zu optimieren.

Typische Cycling-Parameter

Empfohlen werden 25-30 Amplifikationszyklen.

4. Die amplifizierte DNA kann durch Agarosegel-Elektrophorese und anschließender Ethidiumbromid-Färbung.

      Hinweis: Mineralölüberlagerungen können durch eine einfache Chloroform-Extraktion (1:1) entfernt werden, wobei die wässrige Phase zurückgewonnen wird.

Reagenzien für die Nukleinsäure-Elektrophorese

• Agarose (vorgefertigte Gele, Pulver, etc.)
• Puffer wie MOPS-EDTA-Natriumacetat, Tris-Acetat-EDTA (TAE) oder Tris-Borat-EDTA (TBE)
• Gel-Ladelösung und Proben-Ladepuffer für RNA
• Elektrophorese-Färbemittel oder Farbstoff wie Ethidiumbromid

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