Standard-PCR-Protokoll

So führt man eine PCR durch

Ein Standard-PCR-Versuch (Polymerase-Kettenreaktion) besteht aus vier Schritten:

1. Die erforderlichen Reagenzien oder den Mastermix sowie die Matrize in die PCR-Röhrchen geben.
2. Mischen und zentrifugieren.
   *Mineralöl hinzufügen, um eine Verdunstung in einem Thermocycler ohne beheizbaren Deckel zu verhindern.
3. Amplifizieren Sie gemäß den Parametern des Thermocyclers und der Primer.
4. Die amplifizierte DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Ethidiumbromid-Färbung auswerten.

Im Folgenden werden diese Schritte zusammen mit Tipps zur Auswahl der Materialien und Reagenzien näher erläutert. Es handelt sich hierbei um ein grundlegendes PCR-Protokoll unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase.

PCR-Schritte und wesentliche PCR-Komponenten

Die Fehlerbehebung bei einer PCR-Reaktion hängt von vielen Faktoren ab. Sehen Sie sich diese Animation an, um zu erfahren, wie die Auswahl der richtigen Komponenten und Zyklusbedingungen für Ihre Anforderungen dazu beitragen kann, optimale Ergebnisse zu erzielen.

Weitere Protokolle für andere Polymerasen oder fortgeschrittene PCR-Techniken finden Sie im Abschnitt „Protokolle“ unseres Leitfadens zu PCR-Technologien.

Erfahren Sie auf unserer Seite „PCR-Grundlagen“ mehr über die Standard-PCR, einschließlich einer Erklärung, was sie ist.

Reagenzien: Was wird für die PCR benötigt?

Was ist Taq-Polymerase?

Die Taq-DNA-Polymerase ist ein thermostabiles Enzym, das aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen wird. Sie wird häufig zur Amplifikation von DNA-Fragmenten in der PCR verwendet. Das Enzym liegt in rekombinanter Form vor und wird in E. coli exprimiert. Es hält wiederholten Erhitzungen auf 95 °C (wie sie bei der PCR-Technik erforderlich sind) stand, ohne nennenswerten Aktivitätsverlust zu erleiden. Das Enzym weist bei SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ca. 94 kDa auf und zeigt keine nachweisbare Endonuklease- oder Exonukleaseaktivität. Es verfügt über eine 5'→3'-DNA-Polymeraseaktivität sowie eine 5'→3'-Exonukleaseaktivität. Jede Charge der Taq-DNA-Polymerase wird auf PCR-Amplifikation und doppelsträngige Sequenzierung geprüft. Das Enzym wird in einer Konzentration von 5 Einheiten/µL geliefert und enthält einen optimierten 10x-Reaktionspuffer.

Standard-Taq-DNA-Polymerase

Wählen Sie anhand der folgenden Tabelle eine für Ihre Reaktionsbedingungen geeignete Mischung der Taq-DNA-Polymerase aus. Wählen Sie zwischen klaren oder rot gefärbten Formulierungen mit und ohne Magnesiumchlorid (MgCl₂) oder einem vorgefertigten Readymix bzw. Mastermix mit Puffer und dNTPs.

Einheitsdefinition: Eine Einheit bindet innerhalb von 30 Minuten bei 74 °C insgesamt 10 nmol Desoxyribonukleosidtriphosphate in säureausfällbare DNA ein.

Vorgehensweise: Schritte der PCR

Die optimalen Bedingungen für die Konzentration von Taq-DNA-Polymerase, Template-DNA, Primern und MgCl₂ hängen vom verwendeten System ab. Es kann erforderlich sein, die optimalen Bedingungen für jede einzelne Komponente zu ermitteln. Dies gilt insbesondere für die Taq-DNA-Polymerase, die Zyklusparameter und die MgCl₂-Konzentration. Es wird empfohlen, das Enzym und das MgCl₂ zu titrieren, um die optimale Effizienz zu ermitteln.

1. Geben Sie die Reagenzien in der in der Tabelle angegebenen Reihenfolge in ein Röhrchen geeigneter Größe. (Wählen Sie die für den Reaktionsaufbau geeignete Tabelle aus: Standard- oder Readymix-Reagenzien.) Bei einer großen Anzahl von Reaktionen sollte ein Mastermix ohne Matrize angerichtet und in Reaktionsröhrchen aliquotiert werden. Am Ende sollte die Matrize in die entsprechenden Röhrchen gegeben werden.
   

Standard-PCR-Reaktion

*Puffer und Taq-Polymerase zusammen kaufen: D1806, D4309 oder D4545

Fertigmischung für die PCR-Reaktion

2. Vorsichtig mit dem Vortex mischen und kurz zentrifugieren, damit sich alle Bestandteile am Boden des Röhrchens sammeln.

Hinweis: Geben Sie 50 µL Mineralöl in jedes Röhrchen, um eine Verdunstung zu verhindern, falls Sie einen Thermocycler ohne beheizbaren Deckel verwenden.

3. Amplifikation durchführen. Die Amplifikationsparameter variieren je nach den verwendeten Primern und dem Thermocycler. Es kann erforderlich sein, das System für die jeweiligen Primer, die Matrize und den Thermocycler zu optimieren.

Typische Zyklusparameter

Es werden 25–30 Amplifikationszyklen empfohlen.

4. Die amplifizierte DNA kann mittels Agarose-Gelelektrophorese und anschließender Ethidiumbromid-Färbung ausgewertet werden.

      Hinweis: Die Mineralölschicht kann durch eine einmalige Chloroform-Extraktion (1:1) entfernt werden, wobei die wässrige Phase gewonnen wird.

Reagenzien für die Nukleinsäure-Elektrophorese

• Agarose (Fertiggele, Pulver usw.)
• Puffer wie MOPS-EDTA-Natriumacetat, Tris-Acetat-EDTA (TAE) oder Tris-Borat-EDTA (TBE)
• Gel-Auftragslösung und Probenpuffer für RNA
• Elektrophorese-Anfärbemittel oder Farbstoff wie Ethidiumbromid

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