Clonagem e expressão

Vetores de expressão de proteínas

Os plasmídeos, ou vetores de expressão de proteínas, são fragmentos circulares de DNA que contêm diversos elementos funcionais para a clonagem e expressão da proteína de interesse. A seleção do vetor de expressão adequado é parcialmente determinada pelo tipo de proteína, pelo organismo que irá expressá-la e pela aplicação específica e pelas questões científicas que o pesquisador pretende abordar. A ampla variedade de vetores de expressão disponíveis permite que os pesquisadores escolham quais elementos de clonagem, seleção de clones e expressão de proteínas são os mais adequados para seu estudo. Uma vez selecionadas a sequência gênica de interesse e o vetor de expressão, os pesquisadores costumam usar nucleases para cortar com precisão o vetor em locais específicos, permitindo que a sequência genética de interesse seja clonada no quadro de leitura correto e, por fim, expressa em um organismo hospedeiro. É importante ressaltar que os pesquisadores costumam utilizar células quimicamente competentes e transformação bacteriana para hospedar os plasmídeos de DNA recombinante, uma vez que estes se mantêm estáveis quando armazenados congelados a -70 °C.

Como realizar a transfecção de células

A transfecção celular refere-se ao processo de introdução de DNA, RNA ou proteínas em células eucarióticas. Uma variedade de tecnologias físicas, químicas e biológicas está à disposição dos pesquisadores para realizar essa etapa do fluxo de trabalho de expressão de proteínas. Métodos físicos, como a eletroporação, ou métodos químicos, incluindo fosfato de cálcio (CaPi), polietilenimina (PEI) e reagentes de lipofecção, são comumente utilizados pelos pesquisadores. Sistemas de transdução viral, incluindo lentivirais, oncoretrovirais e adenovirais, também estão à disposição dos cientistas. No entanto, o uso de métodos de entrega viral frequentemente requer contenção e monitoramento adicionais por motivos de biossegurança.

Sistemas de expressão de proteínas

Vários organismos são utilizados pelos pesquisadores para expressar a proteína de interesse. As bactérias são comumente utilizadas pelos pesquisadores, pois absorvem vetores de expressão de forma eficiente, apresentam tempos de duplicação rápidos e podem produzir grandes quantidades de proteína recombinante em condições ideais. No entanto, como as bactérias são organismos procarióticos, elas não são capazes de proporcionar as modificações pós-traducionais que algumas proteínas exigem. Células eucarióticas, incluindo leveduras e linhagens celulares de mamíferos, facilitam as modificações pós-traducionais das proteínas e também são comumente utilizadas pelos pesquisadores. A escolha da melhor linhagem celular para a expressão de proteínas recombinantes e da estratégia de expressão depende fortemente das necessidades específicas da aplicação e das questões que o cientista pretende abordar.