qPCR
A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) utiliza moléculas marcadoras fluorescentes para permitir a quantificação dos produtos amplificados. Assim como na PCR convencional, um molde de DNA, cDNA ou RNA é amplificado, mas, a cada ciclo, os sinais fluorescentes são monitorados para a quantificação relativa ou absoluta.
Essa técnica é útil para diversas áreas de pesquisa, incluindo análise de expressão gênica, genotipagem, análise de microRNA, análise de variação genética e análise de proteínas.
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A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um pilar dos laboratórios de biologia molecular. A PCR é utilizada para amplificar o DNA em várias ordens de magnitude, e nossos reagentes e recursos são adequados para diversos fluxos de trabalho de pesquisa, incluindo análise de expressão gênica, genotipagem, sequenciamento e aplicações de mutagênese.
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Como analisar dados de qPCR
A fluorescência das moléculas repórteres é medida e quantificada; normalmente, trata-se de corantes (por exemplo, SYBR® Green, brometo de etídio) que se intercalam entre as bases do DNA de fita dupla, ou sondas projetadas para se ligarem a uma sequência específica (por exemplo, Molecular Beacons, sondas TaqMan®) no DNA.
Quantificação relativa de dados de qPCR
Existem dois métodos principais de quantificação para dados de qPCR. A quantificação relativa, o método mais comum, utiliza a informação ΔΔCt, por meio da qual a razão de expressão ou abundância do gene-alvo na amostra é determinada, comparada a um gene de controle e normalizada com a razão de expressão de um gene de referência. Como os valores de eficiência E para os genes-alvo e de referência diferem, esse método também leva em conta as diferenças nos valores de E. Esse método é empregado com mais frequência na análise de expressão gênica.
Quantificação absoluta de dados de qPCR
O segundo método, a quantificação absoluta, é mais comum na microbiologia ambiental e utiliza a curva-padrão (SC). O método da SC utiliza séries de diluições de concentração conhecida do molde, N0, para criar uma curva padrão por meio da regressão linear de log(N0) em função do CT (ciclo limiar). Isso é então utilizado para calcular as concentrações do molde na amostra. A base desse método é que o valor de eficiência da amostra é o mesmo que o do padrão.
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