Protocolo Padrão de PCR

Como realizar a PCR

Uma configuração padrão da reação em cadeia da polimerase (PCR) consiste em quatro etapas:

1. Adicione os reagentes necessários ou a mistura principal e o molde aos tubos de PCR.
2. Misture e centrifugue.
   *Adicione óleo mineral para evitar a evaporação em um termociclador sem tampa aquecida.
3. Amplificar de acordo com os parâmetros do termociclador e dos primers.
4. Avaliar o DNA amplificado por eletroforese em gel de agarose, seguida de coloração com brometo de etídio.

Essas etapas são apresentadas a seguir com mais detalhes, juntamente com dicas para a seleção de materiais e reagentes. Este é um protocolo básico de PCR que utiliza a Taq DNA polimerase.

Etapas da PCR e componentes essenciais da PCR

A resolução de problemas em uma reação de PCR envolve diversos fatores. Assista a esta animação para saber como a seleção dos componentes e das condições de ciclo adequados às suas necessidades pode ajudar a alcançar resultados ideais.

Encontre protocolos adicionais para outras polimerases ou técnicas avançadas de PCR na seção “Protocolos” do nosso Guia de Tecnologias de PCR.

Saiba mais sobre a PCR padrão, incluindo o que ela é, em nossa página Noções Básicas sobre PCR.

Reagentes: O que é necessário para a PCR?

O que é a Taq polimerase?

A Taq DNA polimerase é uma enzima termoestável derivada da bactéria termofílica Thermus aquaticus. É comumente utilizada para amplificar fragmentos de DNA na PCR. A enzima se apresenta na forma recombinante, expressa em E. coli. É capaz de suportar aquecimentos repetidos a 95 °C (conforme exigido pela técnica de PCR) sem perda significativa de atividade. A enzima possui um peso molecular de aproximadamente 94 kDa, determinado por SDS-PAGE, sem atividade endonuclease ou exonuclease detectável. Possui atividade de DNA polimerase 5'→3' e atividade de exonuclease 5'→3'. Cada lote da Taq DNA Polimerase é testado para amplificação por PCR e sequenciamento de fita dupla. A enzima é fornecida a 5 unidades/µL e vem acompanhada de um tampão de reação 10x otimizado.

Taq DNA Polimerase Padrão

Use a tabela abaixo para selecionar uma mistura adequada de Taq DNA polimerase para suas condições de reação. Escolha entre formulações transparentes ou coradas de vermelho, com ou sem cloreto de magnésio (MgCl₂), ou uma mistura pronta (readymix) ou master mix pré-preparada com tampão e dNTPs.

Definição da unidade: Uma unidade incorpora 10 nmol de desoxirribonucleosídeos trifosfatos totais no DNA precipitável por ácido em 30 minutos a 74 °C.

Procedimento: Etapas da PCR

As condições ideais para a concentração da Taq DNA polimerase, do DNA molde, dos primers e do MgCl₂ dependerão do sistema utilizado. Pode ser necessário determinar as condições ideais para cada componente individualmente. Isso se aplica especialmente à Taq DNA polimerase, aos parâmetros de ciclo e à concentração de MgCl₂. Recomenda-se que a enzima e o MgCl₂ sejam titulados para determinar a eficiência ideal.

1. Adicione os reagentes a um tubo de tamanho adequado, na ordem indicada na tabela. (Selecione a tabela apropriada para a preparação da reação: reagente padrão ou reagente pronto para uso.) Para um grande número de reações, deve-se preparar uma mistura-mestre sem o molde e dividi-la em alíquotas nos tubos de reação. Por fim, o molde deve ser adicionado aos tubos apropriados.
   

Reação de PCR padrão

*Compre o tampão e a Taq polimerase juntos: D1806, D4309 ou D4545

Reação de PCR pronta para uso

2. Misture delicadamente com o vortex e centrifugue rapidamente para que todos os componentes se depositem no fundo do tubo.

Observação: Adicione 50 µL de óleo mineral até o topo de cada tubo para evitar a evaporação, caso utilize um termociclador sem tampa aquecida.

3. Amplifique. Os parâmetros de amplificação variam de acordo com os primers e o termociclador utilizado. Pode ser necessário otimizar o sistema para cada primer, molde e termociclador.

Parâmetros típicos de ciclagem

Recomenda-se 25 a 30 ciclos de amplificação.

4. O DNA amplificado pode ser avaliado por eletroforese em gel de agarose e subsequente coloração com brometo de etídio.

      Observação: A camada de óleo mineral pode ser removida por meio de uma única extração com clorofórmio (1:1), recuperando-se a fase aquosa.

Reagentes para eletroforese de ácidos nucleicos

• Agarose (géis pré-moldados, pó, etc.)
• Tampão, como MOPS-EDTA-acetato de sódio, tris-acetato-EDTA (TAE) ou tris-borato-EDTA (TBE)
• Solução de carregamento de gel e tampão de carregamento de amostra para RNA
• Corante para eletroforese, como o brometo de etídio

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Declaração de Licença da Gravadora

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