Métodos de ensayo de pirógenos

Las endotoxinas son sustancias presentes en las bacterias Gram-negativas. Los pirógenos no endotóxicos son otras sustancias microbianas, entre las que se incluyen las derivadas de bacterias Gram-positivas, virus, levaduras y hongos. Las sustancias pirógenas no microbianas también pueden proceder de partículas de caucho, partículas microscópicas de plástico o compuestos metálicos presentes en los elastómeros.

Existen varios métodos de ensayo para la detección de pirógenos. Se pueden clasificar en función del tipo de contaminante que detectan y de la necesidad de utilizar material de origen animal para realizar el ensayo, tal y como se describe en la tabla siguiente:

Prueba
de pirógenos en conejos

La prueba de pirógenos en conejos (RPT) consiste en medir el aumento de la temperatura corporal de los conejos tras la inyección intravenosa del producto sometido a ensayo. La RPT ofrece resultados cualitativos y su sensibilidad es bastante baja. La fiabilidad de la prueba también es limitada, debido al desarrollo de tolerancia a los pirógenos en los conejos tras inyecciones repetidas, o al estrés que sufren los conejos durante la realización del ensayo.

Nota: La prueba de pirógenos en conejos (RPT) está ahora prohibida en Europa, y la prueba de activación de monocitos (MAT) es el método de elección para detectar tanto pirógenos endotóxicos como no endotóxicos.

Prueba de activación de monocitos

La prueba de activación de monocitos (MAT) es una alternativa a los métodos basados en animales para la detección tanto de pirógenos endotóxicos como no endotóxicos. La prueba de activación de monocitos imita la reacción inmunitaria humana mediante la incubación de monocitos con la muestra analizada. Si hay pirógenos presentes, los monocitos se activan y producen moléculas inflamatorias, las citocinas, responsables de la reacción febril. A continuación, las citocinas se detectan mediante un ensayo inmunológico (ELISA) que utiliza anticuerpos específicos y una reacción enzimática colorimétrica. 

Nota: A partir de julio de 2025, la Comisión de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) recomienda utilizar la prueba de activación de monocitos (MAT) como método preferido para el análisis de endotoxinas y pirógenos no endotóxicos. La prueba de pirógenos en conejos (RPT) está ahora prohibida en Europa.

Lea el artículo y consulte con nuestros expertos para pasar a la prueba MAT de detección de endotoxinas y pirógenos no endotóxicos y seguir así la tendencia normativa. 

Pruebas de endotoxinas bacterianas (prueba LAL)

El método más habitual para la detección de endotoxinas es la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (prueba LAL), un ensayo basado en el lisado de los amebocitos de la sangre del cangrejo herradura. El lisado de las células sanguíneas del cangrejo herradura reacciona de forma natural con las endotoxinas bacterianas en una reacción de coagulación. Este método presenta una alta sensibilidad para la cuantificación de endotoxinas, pero no detecta pirógenos no endotóxicos.

Prueba del BET recombinante (r-FC, r-CR)

El factor C recombinante es una proteína modificada genéticamente que se encuentra normalmente en la cascada del lisado de amebocitos de Limulus. En esta prueba, el factor C reacciona con la endotoxina y se une a un marcador para producir un producto final fluorescente cuantificable. La prueba del factor C recombinante utiliza el mismo principio que la prueba LAL, pero sin necesidad de material de origen animal. 

El reactivo de cascada recombinante (r-CR) es un reactivo multicomponente obtenido mediante ingeniería genética que reconstituye la cascada de coagulación completa presente en el lisado de amebocitos de Limulus. En esta prueba, las proteínas de la cascada —el factor C, el factor B y la enzima procoagulante— reaccionan secuencialmente con la endotoxina para producir un producto final cuantificable. La prueba r-CR reproduce la vía completa de la LAL, pero sin necesidad de material de origen animal.