Standardní protokol pro PCR

Jak provést PCR

Standardní postup polymerázové řetězové reakce (PCR) se skládá ze čtyř kroků:

1. Do zkumavek pro PCR přidejte potřebná činidla nebo mastermix a templát.
2. Promíchejte a odstřeďte.
   *Přidejte minerální olej, aby se zabránilo odpařování v termocykléru bez vyhřívaného víka.
3. Proveďte amplifikaci podle parametrů termocykleru a primerů.
4. Vyhodnoťte amplifikovanou DNA pomocí elektroforézy na agarózovém gelu s následným obarvením ethidiumbromidem.

Tyto kroky jsou níže popsány podrobněji spolu s tipy pro výběr materiálů a reagencií. Jedná se o základní protokol PCR využívající Taq DNA polymerázu.

Kroky PCR a základní komponenty PCR

Řešení problémů s PCR reakcí zahrnuje mnoho faktorů. Podívejte se na tuto animaci a zjistěte, jak výběr správných komponent a podmínek cyklu podle vašich potřeb může pomoci dosáhnout optimálních výsledků.

Další protokoly pro jiné polymerázy nebo pokročilé techniky PCR najdete v sekci „Protokoly“ naší příručky „PCR Technologies Guide“.

Více informací o standardní PCR, včetně toho, co to vlastně je, najdete na naší stránce Základy PCR.

Reagencie: Co je potřeba pro PCR?

Co je Taq polymeráza?

Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Běžně se používá k amplifikaci fragmentů DNA v PCR. Enzym je v rekombinantní formě, exprimovaný v E. coli. Je schopen odolat opakovanému zahřívání na 95 °C (jak to vyžaduje technika PCR) bez významné ztráty aktivity. Enzym má molekulovou hmotnost přibližně 94 kDa stanovenou metodou SDS-PAGE a nevykazuje žádnou detekovatelnou endonukleázovou ani exonukleázovou aktivitu. Má 5'→3' DNA polymerázovou aktivitu a 5'→3' exonukleázovou aktivitu. Každá šarže Taq DNA polymerázy je testována na amplifikaci pomocí PCR a sekvenování dvouvláknových molekul. Enzym se dodává v koncentraci 5 jednotek/µl a je vybaven optimalizovaným 10x reakčním pufrem.

Standardní Taq DNA polymeráza

Pomocí níže uvedené tabulky vyberte vhodnou směs Taq DNA polymerázy pro vaše reakční podmínky. Vyberte si z čirých nebo červeně zbarvených přípravků s chloridem hořečnatým (MgCl₂) nebo bez něj, případně z předem připravených směsí typu „readymix“ nebo „master mix“ s pufrem a dNTP.

Definice jednotky: Jedna jednotka představuje začlenění 10 nmol celkových deoxyribonukleosidtrifosfátů do kyselinou srážitelné DNA za 30 minut při teplotě 74 °C.

Postup: Kroky PCR

Optimální podmínky pro koncentraci Taq DNA polymerázy, templátové DNA, primerů a MgCl₂ závisí na použitém systému. Může být nutné stanovit optimální podmínky pro každou jednotlivou složku. To platí zejména pro Taq DNA polymerázu, parametry cyklů a koncentraci MgCl₂. Pro stanovení optimální účinnosti se doporučuje titrovat enzym a MgCl₂.

1. Přidejte reagencie do zkumavky vhodné velikosti v pořadí uvedeném v tabulce. (Vyberte příslušnou tabulku pro přípravu reakce: standardní nebo hotová směs reagencií.) V případě velkého počtu reakcí je třeba připravit mastermix bez templátu a rozdělit jej do reakčních zkumavek. Na závěr je třeba do příslušných zkumavek přidat templát.
   

Standardní PCR reakce

*Kupte si pufr a Taq polymerázu v jednom balení: D1806, D4309 nebo D4545

Hotová směs pro PCR reakci

2. Jemně promíchejte pomocí vortexu a krátce odstřeďte, aby se všechny složky usadily na dně zkumavky.

Poznámka: Pokud používáte termocyklér bez vyhřívaného víka, přidejte do horní části každé zkumavky 50 µL minerálního oleje, aby se zabránilo odpařování.

3. Proveďte amplifikaci. Parametry amplifikace se budou lišit v závislosti na použitých primerech a termocykleru. Může být nutné optimalizovat systém pro jednotlivé primery, templát a termocykler.

Typické parametry cyklů

Doporučuje se 25–30 amplifikačních cyklů.

4. Amplifikovanou DNA lze vyhodnotit pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a následného obarvení ethidiumbromidem.

      Poznámka: Vrstvu minerálního oleje lze odstranit jednou extrakcí chloroformem (v poměru 1:1) a získat tak vodnou fázi.

Reagencie pro elektroforézu nukleových kyselin

• Agaróza (předem připravené gely, prášek atd.)
• Pufr, např. MOPS-EDTA-octan sodný, tris-acetát-EDTA (TAE) nebo tris-borát-EDTA (TBE)
• Roztok pro nanášení do gelu a pufr pro nanášení vzorků pro RNA
• Barvivo pro elektroforézu, např. ethidiumbromid

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Prohlášení o licenci k štítku

UPOZORNĚNÍ PRO KUPUJÍCÍHO: VYLOUČENÍ LICENCE

Zakoupením tohoto produktu se neuděluje žádná licence na základě žádného z amerických patentů č. 5 804 375, 5 994 056, 6 171 785, 6 214 979, 5 538 848, 5 723 591, 5 876 930, 6 030 787 a 6 258 569 ani na základě odpovídajících patentů mimo území Spojených států, ani na základě jakýchkoli jiných patentů nebo patentových přihlášek týkajících se procesů 5'-nukleázy a barviv vázajících dsDNA. Další informace získáte u ředitele pro licencování společnosti Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Kalifornie 94404, USA