Rychlost, jednoduchost a přesnost stanovení vazby proteinů pomocí BioSPME

M. James Ross, Senior R&D Scientist¹, Olga Shimelis, R&D Manager¹

1 Merck

• Úvod
• Experimentální
  • Stanovení vazby proteinů pomocí BioSPME
  • .Stanovení % volné frakce (FU) léčiva pomocí BioSPME
  • Stanovení vazby na plazmatické bílkoviny pomocí rychlé rovnovážné dialýzy
• Výsledky & Diskuse
  • Přesnost metody BioSPME pro stanovení vazby proteinů pro jednu sloučeninu ve více šaržích kolíčkových nástrojů
  • Přesnost napříč destičkami
  • Přesnost napříč destičkami s jamkamiSrovnání výsledků BioSPME a rychlé rovnovážné dialýzy pro více sloučenin
• Závěr
  • Přednosti metody BioSPME oproti rychlé rovnovážné dialýze
     

Úvod

Důležitým aspektem objevování léčiv je pochopení interakce léčiva s plazmatickými proteiny a lipidy. Část vázaná na proteiny a lipidy se označuje jako vazba na plazmatické proteiny (PPB nebo F_b). Typ léčiva může také poskytnout představu o počtu interakcí s bílkovinami. Obecně platí, že organické kyseliny mají jediné vazebné místo s albuminem, zatímco organické báze budou mít více vazebných míst spojených s glykoproteiny.¹ Kromě albuminu jsou dalšími běžně asociovanými proteiny ve vazbě s léčivem alfa-1-kyselý glykoprotein (AAG) a lipoproteiny, jako je lipoprotein o velmi vysoké hustotě (VHDL) a lipoprotein o nízké hustotě (LDL).² Pokud jde o farmakologickou účinnost léčiva, je to volná frakce nebo nevázaná frakce (F_u) léčiva, která je obecně odpovědná za aktivitu léčiva, jak popisuje hypotéza volného léčiva.^3,4,5

Vazba léčiv na bílkoviny je proto důležitá pro pochopení množství léčiva dostupného v krvi. Historické metody měření vazby na bílkoviny zahrnují ekvilibraci horké plazmy s pufrem bez léčiva přes membránu, která zabraňuje přenosu větších molekul bílkovin do pufru. Jedná se o metodu rovnovážné dialýzy. Další vylepšení produktů pro rovnovážnou dialýzu inzerují zkrácení doby ekvilibrace z tradičních 24 hodin na 4 hodiny pomocí speciálně navržených zařízení.

V této práci byla k měření vazby proteinů použita vysoce výkonná zařízení Supel™ BioSPME C18 a bylo zjištěno, že se doba přípravy vzorku dále zkrátila na méně než jednu hodinu pro krok extrakce. Zařízení BioSPME jsou kompatibilní s robotickými systémy pro manipulaci s kapalinami, což zajišťuje, že extrakci lze plně automatizovat pro skutečně vysoce výkonnou metodiku.⁶ Zařízení BioSPME, bioanalytická mikroextrakce na pevné fázi, byla použita na vybranou sloučeninu, karbamazepin, pomocí vysoce výkonné metody pro 88 vzorků plazmy a 8 vzorků pufru. Tato metoda byla hodnocena ve více šaržích nástrojů Supel™ BioSPME C18 96-pin a pro více sloučenin a prokázala dobrou přesnost a preciznost.
 

EXPERIMENTÁLNÍ

Stanovení vazby proteinů pomocí BioSPME

Lidská plazma a pufr byly nasypány v terapeuticky relevantní koncentraci a inkubovány po dobu jedné hodiny při 37 ^oC při třepání při 300 otáčkách za minutu. Po inkubaci bylo 200 µl plazmy a pufru vloženo do samostatných kolonek na destičku s extrakčními jamkami (n = 8 až 88). Stanovení vazby proteinů bylo provedeno pomocí automatizované robotické metody a nástroje BioSPME C18 96-pin.

Krátce popsáno na obrázku 1, nástroj pin je staticky kondicionován po dobu dvaceti minut v isopropanolu, poté je přenesen do nové jamkové destičky na 10 sekund ve vodě (promývací krok) a následuje extrakční krok. Kolíčkový nástroj se přenese do předem připravené extrakční destičky popsané dříve. Zde kolíčkový nástroj extrahuje analyty při třepání při 1200-1250 otáčkách za minutu při 37 ^oC po dobu 15 minut. Kolíčkový nástroj se vrátí do vodného roztoku k 60sekundovému promytí a nakonec se přenese do desorpční destičky. Desorpční roztok je 80:20 methanol:voda a desorpce se provádí 20 minut za statických podmínek. Vzorky byly analyzovány metodami popsanými v tabulkách 1 a 2.

			Řešení: isopropanol	Čas: 20 min	Podmínka: Statika
⮟
			Řešení: voda	Čas: 10 s	Podmínka: Statika
⮟
Extrakce
Řešení: V případě, že se jedná o výtah, je třeba provést jeho vyčištění: plasma	Čas: 15 min	Podmínka:
⮟
			Řešení: voda	Čas: 60 s	Podmínka: statický
⮟
Desorpce
Řešení: V případě, že se jedná pouze o jednu z následujících možností, je třeba provést analýzu: 80 % methanol	Čas: 20 min	Podmínka:
	⮟
Použití LC-MS/MS

Obrázek 1. Schéma analýzy volné frakce léčiva v lidské plazmě metodou BioSPME.

Stanovení % volné frakce (F_U) léčiva pomocí BioSPME

Metoda BioSPME určuje volnou koncentraci analytu v plazmě porovnáním s extrakcí analytu ze vzorků pufru, kde je 100 % analytu považováno za volné od vazby na bílkoviny.

Procento volné nebo procento nenavázané vazby se stanoví podle rovnice 1:

Rovnice 1:

 

kde koncentrace volná představuje nevázanou koncentraci analytu v matrici, v tomto případě v plazmě, a koncentrace celková představuje celkovou koncentraci analytu. Extrahované množství je nezávislé na jednotkách a může být použito pomocí preferovaných veličin (např. nanogramů nebo molů) M_volné a extrakčního objemu plazmy, V_plazma. Koncentrace analytu v desorpčním roztoku se kvantifikuje pomocí externí kalibrační křivky, a pokud se desorpční objem rovná extrakčnímu objemu plazmy a pufru, koncentrace z desorpce se bude rovnat extrahované koncentraci, jak je uvedeno v rovnici 2. V případě, že se desorpční objem rovná extrakčnímu objemu plazmy a extrakčnímu objemu pufru, bude koncentrace z desorpce rovna extrahované koncentraci:

Rovnice 2:
Rovnice 3:

Vázaný podíl, F_B, lze určit z extrahovaných koncentrací podle rovnice 6.

Rovnice 4:
Rovnice 5:
Rovnice 6:
Rovnice 7:

Obrázek 2. Znázornění extrakčního kroku (vlevo), při kterém se z plazmy (růžová) a pufru (modrá) odstraňují volné analyty (žlutá) a analyty se uvolňují do desorpčního roztoku (vpravo). Extrahované množství nemá velký vliv na koncentraci volného analytu, který se označuje jako nedepleční a nenarušuje rovnováhu části vázané na plazmatické bílkoviny (fialová) (rovnice 6 a 7). Protože se pufrový roztok považuje za 100% bez proteinů, BioSPME extrahuje více z pufru než z plazmy.

V případech, kdy bylo extrakcí BioSPME zjištěno vyčerpání sloučenin z plazmy (extrakce přesáhla 5 % celkového množství spikovaného analytu), bylo nutné provést korekci vypočtené vázané frakce, jak je popsáno níže:

Rovnice 8:

kde B a P, představují příslušná množství extrahovaná z pufru, B, a plazmy, P. B⁰ a P⁰ představuje koncentraci, kterou byly vzorky obohaceny, nebo celkovou koncentraci v pufru nebo biologickém vzorku. Rovnice 8 zohledňuje koncentraci v roztoku po extrakci na hrotu; vyčerpání analytu ze vzorku.⁷ Rovnice 6 a 7, tento faktor nezohledňují. Poskytují však přesné hodnoty, pokud je extrahované množství menší než 5 % celkového množství.

Stanovení vazby plazmatických bílkovin rychlou ekvilibristickou dialýzou

Ekvilibristická dialýza byla provedena podle pokynů v přiloženém návodu. Stručně řečeno, do příslušných komor bylo vloženo 200 µl "nasycené" lidské plazmy o terapeuticky relevantní koncentraci a 400 µl fosfátového pufru (PBS) v nejméně trojnásobném množství. Dialýza probíhala nejméně 4 hodiny při zakrytí a třepání při 300 otáčkách za minutu a 37 ^oC na třepačce Eppendorf. Na konci dialýzy bylo 50 µl špikované plazmy smícháno s 50 µl čistého (nešpikovaného) PBS a 50 µl dialyzátu (pufrovací komora) bylo smícháno s 50 µl čisté plazmy. Toho bylo dosaženo, aby byla zajištěna konzistence matrice. Poté bylo ke každému vzorku přidáno 300 µl ledově vychlazeného acetonitrilu před odstředěním při 5000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 ^oC. Nakonec byl supernatant převeden do skleněných lahviček pro analýzu pomocí LC-MS/MS, jak je popsáno v tabulkách 1 a 2, za použití přístroje AB Sciex 6500 s Agilent 1290 LC s použitím matricově shodné externí kalibrace v desorpčním roztoku.

Výsledky a diskuse

Přesnost metody BioSPME pro vazbu proteinů pro jednu sloučeninu ve více šaržích kolíčkových nástrojů

Pro stanovení vazby karbamazepinu na bílkoviny byly vzorky pufru a plazmy uloženy do 8 jamek vždy ve 3 šaržích kolíčkových nástrojů. Dále bylo testováno 6 pinových nástrojů ze tří šarží z každé šarže. Jak je vidět na obrázku 3, u všech šarží byla získána stejná hodnota vazby na bílkoviny s 1-2% CV. Průměrná hodnota vazby na proteiny ve všech 54 destičkách byla 76,8 ± 2,2 %, což dobře odpovídalo 70-80% rozmezí vazby na proteiny zjištěnému v literatuře pro karbamazepin.

Obrázek 3. Hodnoty vazby na proteiny pro karbamazepin získané pomocí 3 různých šarží kolíčkových nástrojů BioSPME. Každá šarže představuje šest kolíčkových nástrojů. Zeleně je vyznačen průměr z 18 kolíčkových nástrojů pro každou testovanou šarži. Není uveden celkový průměr pro 54 pinových nástrojů (76,8 ± 2,2 %). Žluté čáry představují hranice literárního rozmezí pro vazbu proteinů (70 - 80 %).

Precision across a Well Plate

Kromě prokázání konzistence napříč více nástroji s kolíky byla testována celá destička v takzvané "8 + 88". Číslo 8 představuje sloupec pro extrakci pufru a číslo 88 představuje zbývajících 11 sloupců pro extrakci plazmy. Výsledky napříč celou destičkou lze vidět na obrázku 4 (extrakce analytu). Pro extrakci analytu bylo průměrné extrahované množství v 88 vzorcích plazmy 7,31 ± 0,4 ng/ml (s CV 4,8 %). Průměrné procento vazby pro 88 vzorků bylo 75,9 ± 1,3 %. Jak je patrné z obrázku 5, nedošlo k žádnému vychýlení napříč řádky ani sloupci 96jamkové destičky.

Obrázek 4. Koncentrace analytu (ng/ml) extrahovaného ze vzorků plazmy v každé jamce.

Obrázek 5. Procentní vazba se směrodatnou odchylkou pro každý řádek a sloupec. Žluté čáry představují hranice literárního rozsahu pro vazbu proteinů (70-80 %).

SROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ BioSPME A RYCHLÉ EKVILIBRIOVÉ DIALÝZY PRO VÍCE SLOŽEK

Pomocí rovnic, rovnice 5 a rovnice 6, byly z extrakcí BioSPME stanoveny hodnoty uvedené v tabulce 3 pro vazby analytu na bílkoviny. Tyto hodnoty jsou v dobré shodě s hodnotami stanovenými pomocí zařízení pro rychlou rovnovážnou dialýzu a s uváděnými literárními hodnotami, jak je uvedeno na obrázku 6. 

Obrázek 6. Srovnání hodnot vazby proteinů mezi metodami equilbirum dialýza (žlutá) a BioSPME (zelená). Modré čáry označují interval literárních hodnot vazby proteinů. Sloučeniny s hvězdičkami jsou nabité při fyziologickém pH. Poznámka: u zolpidemu je v literatuře uvedena jediná hodnota, nikoli interval.

Technika BioSPME rovněž přináší více než 50% úsporu času, jak ukazuje tabulka 4. Nejdelším krokem v procesu BioSPME je počáteční inkubace analytu s plazmou (60 minut). To je podstatně kratší doba než minimální čtyřhodinová inkubace, kterou vyžadují ekvilbirové dialyzační přístroje. Díky této metodě BioSPME se celkový počet vzorků, které lze zpracovat, téměř zečtyřnásobil ve srovnání s metodou rychlé ekvilibriální dialýzy.

ZÁVĚR

Výhody metody BioSPME oproti rychlé rovnovážné dialýze

Metoda Supel™ BioSPME C18 technika nabídla 50% úsporu času a zvýšila počet vzorků pro stanovení vazby proteinů ve srovnání s komerčně dostupným produktem pro rovnovážnou dialýzu. BioSPME umožňuje plně automatizovat metodu pomocí standardního robotického systému. Získané hodnoty vazby na proteiny jsou dobře srovnatelné s hodnotami získanými rychlou metodou rovnovážné dialýzy, jak bylo prokázáno u 7 sloučenin s hodnotami log P v rozmezí 1,6 až 5,0. Přesnost extrakce pomocí kolíčkového nástroje byla vynikající u 88 vzorků s CV extrahované koncentrace z plazmy 4,8 %.

Odkazy

1. Cervelli MJ, Russ GR. 2010. Principles of Drug Therapy, Dosing, and Prescribing in Chronic Kidney Disease and Renal Replacement Therapy.871-893. https://doi.org/10.1016/b978-0-323-05876-6.00073-3

2. Scheife RT. 1989. Protein Binding: What Does it Mean?. DICP. 23(7-8):S27-S31. https://doi.org/10.1177/106002808902300706

3. Eichel E. Protein binding changes and drug interactions: What do we know? Current Psychiatry. 2018;38-4.

4. Smith DA, Di L, Kerns EH. 2010. The effect of plasma protein binding on in vivo efficacy: misconceptions in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 9(12):929-939. https://doi.org/10.1038/nrd3287

5. Wanat K. 2020. Biological barriers, and the influence of protein binding on the passage of drugs across them. Mol Biol Rep. 47(4):3221-3231. https://doi.org/10.1007/s11033-020-05361-2

6. Roy KS, Nazdrajić E, Shimelis OI, Ross MJ, Chen Y, Cramer H, Pawliszyn J. 2021. Optimizing a High-Throughput Solid-Phase Microextraction System to Determine the Plasma Protein Binding of Drugs in Human Plasma. Anal. Chem.. 93(32):11061-11065. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c01986

7. Huq M, Tascon M, Nazdrajic E, Roszkowska A, Pawliszyn J. 2019. Measurement of Free Drug Concentration from Biological Tissue by Solid-Phase Microextraction: In Silico and Experimental Study. Anal. Chem.. 91(12):7719-7728. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00983