Kolonie PCR

Koloniální PCR je jednoduchá a rychlá metoda pro ověření správného sestavení klonovaného konstruktu DNA. Tradičně bylo ověření vložení DNA během klonování časově náročné, následovalo po bakteriální transformaci s pracným čištěním DNA a následným štěpením restrikčním enzymem. Kolonizační PCR je přímá metoda PCR, která obchází izolaci DNA i trávení restrikcí a poskytuje rychlé, snadné a levné řešení pro screening klonovaných konstruktů. Aplikace kolonie PCR jsou rovněž kompatibilní se screeningem klonů vytvořených metodami nezávislými na sekvenci a restrikci.

• Protokol kolonie PCR
• Aplikace kolonií PCR s bakteriemi a kvasinkami
• Vliv růstového média na výtěžnost PCR při použití reagencií JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™
• Koloniová PCR a související produkty pro PCR

REDEextrakt-N-A.mp™ PCR ReadyMix™ a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyM.ix™ pro Ckolonie PCR Aaplikace

Vhodný pro použití v aplikacích kolonie PCR, REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ (Kat. No. R4775) a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ (Cat. No. P0982) poskytují pufr, polymerázu, dNTP a stabilizátory jako jediný 2x roztok. Jejich složení umožňuje přímou PCR s následným naložením vzorků na agarózový gel po PCR bez nutnosti použití dalších pufrů nebo nakládacích barviv. Inertní barvivo migruje stejnou rychlostí jako fragment o velikosti 125 párů bází, což poskytuje vizuální potvrzení migrace DNA.

Vlastnosti a výhody

• Ultimátní flexibilita: Purifikace DNA před amplifikací není nutná. Vhodné pro použití s běžnými kmeny E. coli, jako jsou kmeny SIG10 5a, NovaBlue (K-12), BL21(DE3) a DH5α, a také s kvasinkami S. pombe. Vzorek lze také reamplifikovat, například při vnořené PCR.
• Vysoká specifičnost & výtěžnost: JumpStart™  Taq DNA polymeráza, enzym horkého startu inaktivovaný protilátkou, je navržen tak, aby minimalizoval nespecifickou amplifikaci a zároveň zvýšil výtěžnost &; specifičnost cíle. JumpStart^™ Taq amplifikuje cíle o délce až 7 kb.
• Pohodlí: Funkce horkého startu v produktech JumpStart™  umožňují nastavení reakce při pokojové teplotě, což je výhodné při práci s více vzorky. REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ a JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ jsou stabilní při 4 °C nebo -20 °C.
• Tolerance k inhibitorům: Bylo prokázáno, že směs JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ toleruje LB až do 20% koncentrace a LB Agar nebo Terrific Broth až do 10%.
• Reprodukovatelnost:
• Připravenost na gel: Snižuje riziko kontaminace z více kroků pipetování a poskytuje konzistentní výkon v rámci více reakcí.
• Připravenost na gel: Snižuje riziko kontaminace z více kroků pipetování a poskytuje konzistentní výkon v rámci více reakcí: Není třeba přidávat žádný načítací pufr ani sledovací barvivo. Produkt PCR se po amplifikaci načte přímo do agarózového gelu. Červená stopovací látka migruje přibližně stejnou rychlostí jako 125bp fragment (o něco rychleji než bromfenolová modř).

Ckolonie PCR Pprotokol

Protokol PCR kolonií je jednoduchý: Stačí přidat malé množství kolonie z destičky nebo husté bakteriální tekuté kultury do master směsi PCR a přejít k termocyklaci. Během počáteční vysokoteplotní inkubace dojde k lýze buněk. Výsledné produkty PCR lze analyzovat pomocí gelové elektroforézy nebo jiných metod detekce DNA. Tato časově nenáročná metoda je ideální pro screening pouze několika kolonií nebo pro vysoce výkonný screening mnoha klonů.

1. Připravte si master mix PCR (odstupňovaný podle počtu vzorků k analýze):

2. Do každé zkumavky nebo destičky s PCR dávkujte směs PCR master (20 µl).
3. Pomocí sterilní mikropipetové špičky nebo sterilního párátka přeneste buňky z každé kolonie do zkumavky PCR a krátce je promíchejte, aby byly znovu suspendovány v PCR master mixu. Směs může vypadat mírně zakalená. Poznámka: Neodebírejte příliš mnoho buněk. Přetížení buněk by narušilo PCR.
4. Vložte do směsi směs pro PCR. Amplifikujte cílovou DNA za následujících termocyklačních podmínek:

Poznámka: Krok buněčné lýzy je delší než typická počáteční denaturace, aby se účinně porušila bakteriální stěna

5.      Po PCR vložte 5 až 10 µl každé reakce přímo do 1% agarózového gelu, ponechte pruh pro vhodný žebříček a proveďte elektroforézu.

Colony PCR Aaplikace s Bbakteriemi a Ykvasinkami

Kolonická PCR byla provedena s použitím reprezentativních kmenů bakterií a kvasinek. E. coli kompetentní buňky SIG10 5a (kat. č. CMC0001), NovaBlue (kat. č. 69825), BL21(DE3) (kat. č. 69450) a DH5α (Thermo Fisher Scientific) byly transformovány pomocí pET28a(+) obsahující vloženou sekvenci. SIG10 5a byl také transformován prázdným vektorem pET28a(+). Kolonie E. coli byly prověřeny na přítomnost inzertu pomocí REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ a doprovodných primerů, které amplifikují 1 kbp inzertu. Všechny kmeny E. coli byly kompatibilní s PCR kolonií a produkovaly cílové amplikony přímo ze vstupů surových buněk bez kroku extrakce DNA (obrázek 1).

Obrázek 1 Agarosový gel produktů E. coli koloniální PCR. Koloniální PCR 1 kbp inzertu byla provedena pomocí směsi REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™ a analyzována na 1% agarózovém gelu. Produkty byly detekovány ze všech transformovaných buněk obsahujících pET28a(+) s inserty (vzorky 3-10), zatímco z buněk transformovaných prázdným vektorem pET28a(+) (vzorky 1-2) nebyl amplifikován žádný produkt.

Kvasinky Schizosaccharomyces pombe byly transformovány pomocí pESP-1. Na výsledných koloniích a kontrolním plazmidu byla provedena PCR. Kolonie kvasinek byly vyšetřeny na přítomnost inzertu pomocí směsi JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ a doprovodných primerů, které amplifikují 226 bp inzertu.  Stejně jako E. coli byly cílové sekvence amplifikovány ze vzorků kvasinek bez purifikace DNA (obrázek 2).

Obrázek 2 Agarosový gel produktů PCR kolonií S. pombe. Koloniální PCR 226 bp inzertu byla provedena pomocí směsi JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ a analyzována na 1% agarózovém gelu. Produkty byly detekovány ze všech transformovaných buněk (kolonie 1-3) a plazmidového templátu (kontrola).

Evliv na Grůst Media na PČR Ypolí Using./span> JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ Ragens

Pro kvantifikaci vlivu kontaminace růstového média na PCR byly použity běžné E. coli média LB, LB Agar a Terrific Broth (TB) byly nasypány do činidel JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™. Amplifikace byla provedena s pBR322 jako templátem, příslušnými primery, α [32P] dCTP a různými hladinami (0 - 50 %) LB, LB Agaru a TB. Výtěžnost PCR byla stanovena po vysrážení kyseliny trichloroctové na skleněných filtrech a následném scintilačním počítání. Výtěžnost byla normalizována na 0 % přidaného média. Reakce byly provedeny ve třech opakováních. Všechny přídavky médií měly vliv na výtěžnost produktů, ale PCR s použitím směsi JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ byla stále robustní, když až 20 % reakční směsi tvořil LB a až 10 % reakční směsi tvořil TB nebo LB agar (obrázek 3). Tyto hodnoty přesahují úroveň, která by kontaminovala typickou koloniální PCR, a dokládají vysokou toleranci činidel JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ vůči inhibitorům.

Obrázek 3 Výsledky nasypání LB, LB agaru a TB do činidel PCR ReadyMix™. LB, růžové čtverce; LB agar, modré kosočtverce; TB, zelené trojúhelníky.

Colony PCR Performance s JumpStart^TM a REDTaq^® ReadyMix^™ Ragenti

REDExtract-N-Amp™ PCR ReadyMix™, JumpStart™ REDTaq^® PCR ReadyMix™ a další směsi JumpStart PCR ReadyMix™ a další směsi JumpStart PCR ReadyMix™.sup>™ a REDTaq^® ReadyMix^™, jako jsou R2523 a P1107, jsou robustní master směsi, které umožňují přímou PCR kolonií a kultur z běžných klonovacích a expresních kmenů, včetně E. coli a S. pombe, což usnadňuje rychlý screening klonovaných konstruktů. Mají vysokou toleranci k běžným inhibitorům PCR, včetně LB koncentrace až 20 % a LB Agaru nebo Terrific Brothu až 10 %, což vede k vysoké výkonnosti při PCR kolonií. Master směsi dokáží překonat účinky buněčných zbytků a lze je použít přímo se surovými koloniemi nebo suspenzemi pro amplifikaci cílů o délce až 7 kb. K dispozici jsou také další ultra rychlé master směsi pro PCR, včetně naší KOD One^™ PCR Master Mix vhodné pro aplikace koloniální PCR. Další reagencie a zdroje pro PCR naleznete v našem Hubu zdrojů reagencií a sad pro PCR.