Kloning & Ekspresi

Vektor Ekspresi Protein

Plasmid, atau vektor ekspresi protein, adalah potongan melingkar DNA yang mengandung banyak elemen fungsional untuk mengkloning dan mengekspresikan protein yang diinginkan. Pemilihan vektor ekspresi yang tepat sebagian ditentukan oleh jenis protein, organisme yang akan mengekspresikan protein, dan aplikasi spesifik serta pertanyaan ilmiah yang ingin dijawab oleh peneliti. Berbagai macam vektor ekspresi yang tersedia memungkinkan para peneliti untuk memilih kloning, pemilihan klon, dan elemen ekspresi protein mana yang terbaik untuk penelitian mereka. Setelah urutan gen yang diminati dan vektor ekspresi dipilih, para peneliti biasanya menggunakan nuklease untuk memotong vektor secara tepat di tempat tertentu untuk memungkinkan urutan genetik yang diminati dikloning dalam bingkai dan akhirnya diekspresikan dalam organisme inang. Yang penting, para peneliti biasanya akan menggunakan sel yang kompeten secara kimiawi dan transformasi bakteri untuk menjadi inang plasmid DNA rekombinan karena stabil ketika disimpan dalam keadaan beku pada suhu -70°C.

Bagaimana cara mentransfeksi sel

Transfeksi sel merujuk pada proses memasukkan DNA atau RNA, atau protein ke dalam sel eukariotik. Berbagai teknologi fisik, kimia, dan biologi tersedia bagi para peneliti untuk menyelesaikan bagian dari alur kerja ekspresi protein ini. Metode fisik, seperti elektroporasi, atau metode kimia, termasuk kalsium fosfat (CaPi), polietilenimin (PEI), dan reagen lipofeksi, semuanya umum digunakan oleh para peneliti. Sistem transduksi virus, termasuk lentiviral, oncoretroviral, dan adenoviral juga tersedia bagi para ilmuwan. Namun, penggunaan metode pengiriman virus sering kali membutuhkan penahanan dan pemantauan tambahan untuk alasan keamanan hayati.

Sistem Ekspresi Protein

Berbagai organisme digunakan oleh para peneliti untuk mengekspresikan protein yang mereka minati. Bakteri umumnya digunakan oleh para peneliti karena mereka secara efisien menyerap vektor ekspresi, memiliki waktu penggandaan yang cepat, dan dapat menghasilkan protein rekombinan dalam jumlah besar dalam kondisi optimal. Namun, karena bakteri adalah organisme prokariotik, mereka tidak dapat menyediakan modifikasi pasca-translasi protein yang dibutuhkan oleh beberapa protein. Sel eukariotik, termasuk ragi dan garis sel mamalia, memfasilitasi modifikasi pasca-translasi protein dan juga umum digunakan oleh para peneliti. Pilihan garis sel terbaik untuk ekspresi protein rekombinan dan strategi ekspresi protein sangat bergantung pada kebutuhan aplikasi spesifik dan pertanyaan yang ingin dijawab oleh ilmuwan.