Sequenziamento di nuova generazione

Panoramica sui metodi NGS

Sebbene la metodologia e i reagenti per l’NGS siano in continua evoluzione, oggi i ricercatori hanno a disposizione numerosi sistemi NGS. Le piattaforme comunemente utilizzate integrano diverse fasi critiche del flusso di lavoro NGS, tra cui la preparazione dei campioni o delle librerie, la generazione di cluster, il sequenziamento e l’analisi dei dati. La preparazione dei campioni comporta in genere l’amplificazione del DNA o l’aggiunta di linker o adattatori di sequenza. La generazione di cluster di ciascuna sequenza di DNA avviene quando il DNA contenente il linker legato covalentemente si ibrida a una superficie solida per l’amplificazione tramite PCR a ponte, oppure tramite metodi alternativi quali la PCR in emulsione. Inoltre, esistono numerosi metodi di sequenziamento del DNA, tra cui il sequenziamento per ligazione, il sequenziamento per sintesi, il pirosequenziamento e il sequenziamento a semiconduttori ionici. Ciascun metodo di sequenziamento prevede fasi di reazione e composizioni chimiche diverse che, in ultima analisi, determinano la lunghezza di ciascuna sequenza (lunghezza di lettura), il tasso di errore e il costo dei reagenti.

Approcci analitici per l’analisi dei dati NGS

Un elemento fondamentale per tutti i flussi di lavoro NGS è la fase critica di analisi dei dati che segue il sequenziamento. Sebbene ogni piattaforma e flusso di lavoro NGS produca un’enorme quantità di informazioni digitali acquisite su computer, il set di dati grezzi deve essere analizzato da bioinformatici utilizzando un numero sempre crescente di strumenti analitici per l’allineamento e la mappatura delle letture, quali Bowtie, Galaxy e molti altri. Molti degli sviluppi nel campo delle tecnologie NGS derivano dalla fusione di numerosi settori scientifici, finalizzata a sviluppare e ottimizzare l’analisi e l’interpretazione di insiemi di dati di tali dimensioni. A seconda delle specifiche esigenze applicative, i ricercatori sono ora in grado di utilizzare questi potenti strumenti per sequenziare interi genomi, esomi o trascrittomi a fini di ricerca fondamentale e clinica.