qPCR
La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) utilizza molecole segnalatrici fluorescenti per consentire la quantificazione dei prodotti amplificati. Come nella PCR convenzionale, viene amplificato un modello di DNA, cDNA o RNA, ma ad ogni ciclo vengono monitorati i segnali fluorescenti per la quantificazione relativa o assoluta.
Questa tecnica è utile in numerosi ambiti di ricerca, tra cui l’analisi dell’espressione genica, la genotipizzazione, l’analisi dei microRNA, l’analisi delle variazioni genetiche e l’analisi delle proteine.
Categorie in primo piano
La reazione a catena della polimerasi (PCR) è uno strumento fondamentale nei laboratori di biologia molecolare. La PCR viene utilizzata per amplificare il DNA di diversi ordini di grandezza e i nostri reagenti e risorse sono adatti a numerosi flussi di lavoro di ricerca, tra cui l’analisi dell’espressione genica, la genotipizzazione, il sequenziamento e le applicazioni di mutagenesi.
Metodi e protocolli di clonazione molecolare ed espressione proteica per una clonazione affidabile e un'espressione proteica stabile mediante vettori di espressione proteica derivati da insetti, batteri e mammiferi.
Reagenti e risorse epigenetiche per lo studio delle specie di RNA, della metilazione del DNA, delle modificazioni della cromatina e delle modificazioni degli istoni.
Analisi completa del microbioma intestinale: scopri una soluzione olistica che comprende la preparazione dei campioni, il sequenziamento, la bioinformatica e la statistica. Dal 16S al WGS.
Come analizzare i dati della qPCR
La fluorescenza delle molecole reporter viene misurata e quantificata; in genere si tratta di coloranti (ad esempio SYBR® Green, bromuro di etidio) che si intercalano tra le basi del DNA a doppia elica, oppure di sonde progettate per legarsi a una sequenza specifica (ad esempio Molecular Beacons, sonde TaqMan®) sul DNA.
Quantificazione relativa dei dati qPCR
Esistono due principali metodi di quantificazione dei dati qPCR. La quantificazione relativa, il metodo più comune, utilizza le informazioni ΔΔCt, grazie alle quali viene determinato il rapporto di espressione o di abbondanza del gene bersaglio nel campione, rispetto a un gene di controllo, e normalizzato con il rapporto di espressione di un gene di riferimento. Poiché i valori di efficienza E per i geni bersaglio e di riferimento differiscono, questo metodo tiene conto anche delle differenze nei valori di E. Questo metodo è impiegato più frequentemente nell’analisi dell’espressione genica.
Quantificazione assoluta dei dati qPCR
Il secondo metodo, la quantificazione assoluta, è più comune nella microbiologia ambientale e si avvale della curva standard (SC). Il metodo SC utilizza una serie di diluizioni di una concentrazione nota del modello, N0, per creare una curva standard mediante la regressione lineare di log(N0) rispetto al CT (ciclo di soglia). Questa viene poi utilizzata per calcolare le concentrazioni del modello nel campione. Il presupposto di questo metodo è che il valore di efficienza del campione sia uguale a quello dello standard.
Cerchi informazioni più specifiche?
Visita la nostra sezione di ricerca documenti per schede tecniche, certificati e documentazione tecnica.
Articoli correlati
- Dopo aver completato una PCR tradizionale, l'analisi dei dati della PCR/qPCR viene condotta mediante risoluzione attraverso un gel di agarosio o, più recentemente, attraverso un capillare.
- Quantitative PCR detection builds on basic PCR techniques and allows researchers to estimate the quantity of starting material in a sample with a much wider dynamic range.
- PCR assay guide navigates you through primer validation and other assay optimization factors to ensure high sensitivity and specificity for optimum DNA/ RNA quantification.
- PCR workflow's variability influenced by sample source, reverse transcription, and assay design, impacting reproducibility.
- The purpose of Hot Start PCR is to inhibit the PCR reaction in order to reduce nonspecific amplification, prevent the formation of primer dimers, and increase product yields.
- Vedi tutto (36)
Protocolli correlati
- Il nostro protocollo SYBR Green qPCR è un metodo progettato per la quantificazione accurata dell'espressione genica e delle reazioni RT-PCR.
- Chromatin Immunoprecipitation qPCR for studying gene regulation across conditions.
- Primer Concentration Optimization Protocol creates reaction matrix for testing primer concentrations against various partners.
- Optimization of qPCR conditions is important for the development of a robust assay. The two main approaches are optimization of primer concentration and/or annealing temperatures.
- Multiplex qPCR employing probe-based chemistries is a demanding application that often requires extensive optimization and validation.
- Vedi tutto (29)
Scopri altri articoli e protocolli
Come possiamo aiutarti
In caso di domande, invia una richiesta
di assistenza clienti oppure contatta il nostro team di assistenza clienti:
Invia un'e-mail all'indirizzo custserv@sial.com
oppure chiama il numero +1 (800) 244-1173
Assistenza aggiuntiva
- Calcolatrici e app
Web Toolbox - strumenti e risorse di ricerca scientifica per la chimica analitica, le scienze della vita, la sintesi chimica e la scienza dei materiali.
- Richiesta di assistenza clienti
Assistenza clienti inclusa assistenza per ordini, prodotti, account e problemi tecnici del sito web.
- Domande frequenti
Consulta la nostra sezione "Domande frequenti" per trovare le risposte alle domande più ricorrenti sui nostri prodotti e servizi.