Metodi di analisi dei pirogeni

Tre tipi di pirogeni sono raffigurati in blu, ciano e magenta su uno sfondo giallo.

Il test pirogenico determina la quantità di pirogeni presenti nei prodotti farmaceutici o biofarmaceutici per via parenterale ed è disciplinato da diverse norme emanate da organismi quali la Food and Drug Administration (FDA), la Farmacopea degli Stati Uniti (USP) o la Farmacopea Europea (EP). La sterilità di un prodotto non implica che esso sia privo di pirogeni. Pertanto, anche i farmaci che si ritengono sterili devono essere sottoposti a test per i pirogeni al fine di prevenire reazioni febbrili nei pazienti.

La contaminazione da pirogeni può verificarsi durante la produzione o la somministrazione di prodotti farmaceutici, bioterapici e dispositivi medici, ma la presenza di pirogeni può anche essere una caratteristica intrinseca del prodotto, come nel caso degli adiuvanti nei vaccini o dei lipopeptidi sintetici.

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Scatola bianca aperta con l'etichetta “PyroMAT Kit Pyrogen Detection Assay”, con piccole bottiglie, fiale e un set di reagenti per piastra a 96 pozzetti disposti attorno ad essa.

Test sui pirogeni

Garantire la sicurezza: analisi dei pirogeni nei prodotti farmaceutici mediante il Monocyte Activation Test (MAT) per rilevare la presenza di pirogeni endotossici e non endotossici.

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Una sofisticata ambientazione da laboratorio per test di sterilità, incentrata su uno strumento digitale dotato di tubi. Intorno ad esso sono disposte varie bottiglie piene di liquido dai toni trasparenti e ambrati, affiancate da piastre di Petri contenenti terreni di coltura blu, rossi e trasparenti. Una rastrelliera di fiale con tappi rossi suggerisce la presenza di campioni preparati o terreni di coltura.

Materiali di consumo, terreni di coltura e strumenti per i test di sterilità

Strumenti da laboratorio e materiali di consumo per i test di sterilità nel controllo di qualità microbiologico: terreni di coltura per test di sterilità, pompe, apparecchiature e accessori.

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Uno scienziato, che indossa un DPI completo, osserva un campione al microscopio.

Che cos’è un pirogeno?

Un pirogeno è una sostanza che provoca un aumento della temperatura (reazione febbrile) nell'uomo o negli animali attraverso l'attivazione del sistema immunitario innato. Costituiscono un gruppo eterogeneo di contaminanti che comprende sostanze microbiche e non microbiche. I pirogeni possono essere classificati in due gruppi: endotossine e pirogeni non endotossici (NEP).

Le endotossine sono sostanze presenti nei batteri Gram-negativi. I pirogeni non endotossici sono altre sostanze microbiche, comprese quelle derivate da batteri Gram-positivi, virus, lieviti e funghi. Le sostanze pirogeniche non microbiche possono anche provenire da particelle di gomma, particelle microscopiche di plastica o composti metallici presenti negli elastomeri.

Sono disponibili diversi metodi di prova per la rilevazione dei pirogeni. Essi possono essere classificati in base al tipo di contaminante che rilevano e alla necessità di utilizzare materiali di origine animale per eseguire la prova, come descritto nella tabella sottostante:

Test
pirogenico sui conigli

Il test dei pirogeni nei conigli (RPT) consiste nel misurare l’aumento della temperatura corporea dei conigli in seguito all’iniezione endovenosa del prodotto in esame. L’RPT fornisce risultati qualitativi e la sua sensibilità è piuttosto bassa. Anche la robustezza del test è limitata, a causa dello sviluppo di tolleranza ai pirogeni nei conigli dopo iniezioni ripetute o dello stress a cui sono sottoposti gli animali durante l’esecuzione del test.

Nota: il test dei pirogeni nei conigli (RPT) è ora vietato in Europa e il test di attivazione dei monociti (MAT) è il metodo di scelta per rilevare sia i pirogeni endotossici che quelli non endotossici.

Test di attivazione dei monociti

Il test di attivazione dei monociti (MAT) è un’alternativa ai metodi basati sull’uso di animali per la rilevazione sia dei pirogeni endotossici che di quelli non endotossici. Il test di attivazione dei monociti riproduce la reazione immunitaria umana incubando i monociti con il campione in esame. Se sono presenti pirogeni, i monociti vengono attivati e producono molecole infiammatorie, le citochine, responsabili della reazione febbrile. Le citochine vengono quindi rilevate mediante un test immunologico (ELISA) che prevede l’uso di anticorpi specifici e una reazione enzimatica colorata.

Nota: a partire da luglio 2025, la Commissione della Farmacopea Europea (Ph. Eur.) raccomanda l’uso del test di attivazione dei monociti (MAT) come metodo preferito per l’analisi delle endotossine e dei pirogeni non endotossici. Il test dei pirogeni sul coniglio (RPT) è ora vietato in Europa.

Leggi l’articolo e approfondisci l’argomento con i nostri esperti per passare al MAT, che rileva endotossine e pirogeni non endotossici, e per allinearti alle tendenze normative.

Analisi delle endotossine batteriche (test LAL)

Il metodo più comune per l’analisi delle endotossine è il test del lisato di amebociti di Limulus (test LAL), un saggio basato sul lisato degli amebociti presenti nel sangue del granchio a ferro di cavallo. Il lisato delle cellule ematiche del granchio a ferro di cavallo reagisce naturalmente con le endotossine batteriche in una reazione di coagulazione. Questo metodo presenta un’elevata sensibilità per la quantificazione delle endotossine, ma non rileva i pirogeni non endotossinici.

Test del BET ricombinante (r-FC, r-CR)

Il Fattore C ricombinante è una proteina ingegnerizzata geneticamente che si trova normalmente nella cascata del lisato di amebociti di Limulus. In questo test, il Fattore C reagisce con l’endotossina e si lega a un marcatore per produrre un prodotto finale fluorescente quantificabile. Il test del Fattore C ricombinante utilizza lo stesso principio del test LAL, ma senza la necessità di materiale di origine animale.

Il reagente della cascata ricombinante (r-CR) è un reagente multicomponente ingegnerizzato geneticamente che ricostituisce la cascata di coagulazione completa presente nel lisato di amebociti di Limulus. In questo test, le proteine della cascata — il Fattore C, il Fattore B e l’enzima procoagulante — reagiscono in sequenza con l’endotossina per produrre un prodotto finale quantificabile. Il test r-CR riproduce l’intero percorso del test LAL, ma senza la necessità di utilizzare materiale di origine animale.

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