N-Glycosidase F プロトコル＆トラブルシューティング

 

プロトコル

N-グリコシダーゼF（製品番号NGLYF-RO）をPBSおよび他の非変性バッファー中で溶けにくいタンパク質とともに使用

以下のプロトコルの使用を検討します。
タンパク質100 μgを8 M尿素＋0.5 M β-メルカプトエタノール溶液250 μLで希釈します（1 M Trisを用いてpH 7.5に調整）。
37℃で一晩インキュベートします。
20 mMヨードアセトアミド＋50 mMリン酸カリウムに対して透析します。
50 mMリン酸カリウム、pH 7.5に対して透析します（2時間×4回）。
12 Uの酵素を添加し、37℃で一晩消化させます。

トラブルシューティング

変更した反応条件

本酵素は尿素および塩化グアニジウム両方の濃度が高い場合、不安定ですが、基質として尿素で変性した糖タンパクを使用することができます。
尿素を除去する手技は「プロトコル」に記載されています。
DTTは濃度に関係なく干渉しません。