중합효소연쇄반응(PCR) 애플리케이션
중합효소연쇄반응(PCR)은 다양한 소스에서 특정 DNA 또는 RNA 서열을 증폭하기 위한 효율적이고 신속한 in vitro 방법으로, 강력한 핵심 분자생물학 기술입니다. 표준 PCR은 표적 DNA, 표적 DNA 서열을 둘러싸는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 한 세트, 내열성 DNA 중합효소(일반적으로 Taq polymerase) 그리고 뉴클레오티드로 구성됩니다. 유전자증폭장치(thermal cycler)를 사용하는 각각의 증폭 주기 동안 세 개의 단계 즉, 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 별도의 단일 가닥 DNA로 변성(denaturing), 표적 DNA 서열에 프라이머 결합(annealing) 그리고 신장(extension)이 포함되며, 여기에서 DNA 중합효소가 프라이머로부터 DNA를 신장하여 한 개의 기존 가닥과 한 개의 신규 가닥으로 새로운 dsDNA를 생성합니다. 한 단계에서 합성된 가닥은 다음 단계에서 주형(template)의 역할을 하여, 고작 20개 주기에서 DNA의 양이 백만 배 증가하는 결과를 가져옵니다.
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역전사효소 PCR(RT-PCR)
RT-PCR 또는 역전사효소 PCR은 표준 PCR 기술의 변형이며 상당히 소량의 시료에서 얻은 특정 mRNA의 증폭을 포함합니다. 기존 클로닝 기술에 필요한 지루한 mRNA 정제 과정이 필요하지 않습니다. RT-PCR을 이용하면, 역전사효소 및 RNA 시료를 표준 PCR 시약에 추가로 사용합니다. 반응 혼합물을 37 ˚C까지 가열하면, 역전사효소에 의해 RNA 시료로부터 상보적인 cDNA 복사본이 생산됩니다. 이러한 cDNA는 프라이머에 결합하여 최초 가닥 합성을 이끌어 냅니다. 여기서부터 표준 PCR을 따르며 최종적으로 dsDNA가 생성됩니다. RT-PCR은 세포와 조직의 전사 수준을 정량화하는 데 널리 사용되는 실시간 PCR(qPCR)과 결합되는 경우가 많습니다.
핫스타트(hot start) PCR
핫스타트 PCR은 열 활성화 단계가 발생할 때까지 핫스타트 Taq 중합효소 또는 반응 설정 동안 변형된 dNTPs의 통합을 억제하는 기술입니다. 핫스타트 중합효소 활성을 정지시키기 위한 여러가지 방법이 있으며, 화학적 변형, 항체 주도형 및 압타머(aptamer) 주도형 방법이 포함됩니다.
긴 표적의 정확한 증폭을 위한 앤드포인트(Endpoint) PCR
앤드포인트 PCR 반응은반응 완료 시 표적의 존재 및 상대적 존재비를 검출하는 데 종종 사용됩니다. 표준 PCR에서 생성되는 서열의 길이 제한인 약 5 kb는 “교정” 활성을 제공하는 추가적인 요인을 통합하여 부분적으로 극복할 수 있습니다. 롱 앤드 애큐레이트(Long and accurate, LA) PCR은 3′→5′ 핵산단말분해효소가 있는 두 번째 내열성 중합효소를 사용하여 종말 뉴클레오티드 오편입(misincorporation)을 수리하므로, 크게 향상된 신뢰성과 최대 길이 40 kb의 표적 DNA를 증폭하는 능력의 결과를 낳습니다.
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