Conferma^® ELISA: 설계에 따른 시료 검출 및 분석 일관성

강력한 시료 검출 및 장기간 분석에서 일관성이 필요할 때는 Conferma^® ELISA를 사용해보세요. 머크의 ELISA는 주요 시약부터 완제품 분석까지 로트 간 일관된 성능에 집중적으로 주력하여 자체적으로 개발 및 제조되었습니다. 

Conferma^® ELISA의 원칙 요약:

• 품질 관리(낮음, 중간, 높음)를 포함하는 완전한 96웰 분석
• 핵심시약은 로트별로 물리화학적으로 엄격하게 평가됨
• 재현성 확인을 위해 확립된 gold standard
• 로트 출하 테스트로 내인성 시료(endogenous sample)와의 가교를 확립

그림 1. Conferma^® ELISA는 높은 수준의 시료 검출 및 로트 간 일관성을 제공합니다. (A.) 분석물 TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1에 대해 Conferma^® ELISA를 사용한 정상 및 질병 혈청 시료에서 시료 검출 백분율(검출 한계(LOD) 초과 데이터에 대해). (B.) TNF-α ELISA의 완제품 키트 검사 예시. 3개의 로트에서 얻은 교정 곡선을 수학적 유사성에 대해 비교하였으며 1 값은 완벽한 평행성으로 간주됩니다. 로트 1, 2, 3은 각각 파란색, 노란색, 마젠타색의 선으로 표시됩니다. 로트 1에 대한 로트 2의 평행성은 0.983이었으며 로트 1에 대한 로트 3은 0.992였습니다.

Conferma^® ELISA 방법 소개

연구 전용(RUO) 분석은 초기 연구 단계부터 임상시험까지 광범위한 연구에 사용됩니다. RUO 태그는 제조업체에 규제적 부담을 주지 않지만, ICH M10 지침¹ 같은 문서는 최종 사용자에게 연구의 특성에 따라 시행하도록 요구하는 엄격한 룰을 보여줍니다. 연구의 이런 영역을 해결하기 위해 고강도 검증에 끄떡없으면서도 모든 연구자가 규격품으로 사용할 수 있는 분석을 만드는 것이 필요합니다. 이를 염두에 두고 당사는 엄격한 QC 절차를 사용하면서 중요한 시약에 대한 자세한 평가와 엄격한 R&D 테스트를 수행합니다. Conferma^® ELISA 방법의 각 단계에 대한 상세 정보를 알아 보려면 계속 읽어보세요.

• Conferma^® ELISA가 작동하는 방법
• 주요 시약 검증
• 분석 검사 원칙 및 기술
• 로트 간 일관성 검사
• Conferma^® ELISA 제품

Conferma^® ELISA가 작동하는 방법

Conferma^® ELISA는 샌드위치 ELISA 형식을 따릅니다. 샌드위치 ELISA는 시료의 항원 수준을 측정하고 이를 유사한 표적이 알고 있는 농도 수준에서 (일반적으로 연속 희석된 농도들과) 반응한 표준 곡선과 비교하는 일반적인 효소결합면역흡착분석(ELISA) 절차입니다. 항원은 포집 항체와 검출 항체라는 두 개의 항체 사이에 "샌드위치"됩니다. 이러한 항체는 각각 다클론 항체 또는 Conferma^® ELISA와 마찬가지로 단클론 항체(mAb)가 될 수 있습니다. 샌드위치 ELISA는 바이오마커를 분석하기 위한 항체 검출에 있어 더 민감하고 독특한 유형의 ELISA 중 하나로 여겨집니다. 올바른 단백질이 식별되었는지 확인하기 위해서 두 개의 독특한 에피토프가 필요하기 때문입니다. 그림 2는 이러한 Conferma^® 분석법이 작동하는 방법을 나타냅니다.

그림 2. Conferma^® ELISA가 작동하는 방법. Conferma^® ELISA는 샌드위치 ELISA 방법을 사용하여 바이오마커 측정을 위한 항체를 검출합니다. 여기에는 96웰 플레이트에서 포집 항체를 사전 코팅하고, 표적이 포함된 시료를 추가하고 표준 물질을 추가하는 것이 포함됩니다. 바이오틴 표지된 검출 항체를 웰에 추가하고 horseradish peroxidase (HRP)-streptavidin과 함께 배양하여 샌드위치를 완성하고 농도 측정을 위한 신호를 제공합니다.

주요 시약 검증

단클론 항체 및 재조합형 교정 단백질(표준 물질/QC)인 Conferma^® 주요 시약은 미국 캘리포니아주와 이스라엘에 소재한 머크의 센터에서 자체적으로 생산됩니다. 폭넓은 검사를 통해 시약의 유사성 및 성능을 확인합니다. 예를 들어, 교정 단백질은 UniProt에 공개된 성숙 시퀀스과 아주 유사하며 해당 분석의 mAb는 이에 대해 높은 친화성을 가집니다.

Conferma^® 주요 시약을 검사하기 위해 다음의 물리화학적 기술을 사용합니다.

• 질량분석법(LC-MS/MS & RP-LC-UV-MS, 그림 3 및 표 1): 단백질의 시퀀스를 제공하고 측정된 질량을 결정
• SPR(표면 플라즈몬 공명, 표 2): 각 mAb의 표준 물질에 대한 높은 친화성(K_D <0.5 nM) 확인
• AAA(아미노산 분석): 단백질 농축을 위한 황금 표준 물질 

그림 3. LC-MS/MS 분석. LC-MS 분석에 기반한 IL-6 Conferma^® ELISA 교정물질 두 가지 로트에 대한 시퀀스 커버리지. 파란색 강조는 IL-6의 식별된 시퀀스를 보여줍니다.

표 1. RP-LC-UV-MS 분석. IL-6 Conferma^® ELISA 시약 로트별 결과(교정 단백질 및 mAb)를 질량(Da) 및 바이오틴 접합 검출 항체의 몰(mole) 분포와 비교. 교정된 시퀀스와 완전한 질량 데이터의 비교는 시퀀스가 UniProt 수납번호 P05231, AA30-212에서 보고된 시퀀스와 일치한다는 것을 뒷받침합니다.

시료	측정된 질량(Da)
교정물질 로트 028M4878V	20,977
교정물질 로트 015M4836V	20,977
포집 항체 IL6.2F2(로트 RB1811028)	148,728
포집 항체 IL6.2F2(로트 RB1812003)	148,735
포집 항체 IL6.2F2(로트 RB1912001)	148,728
검출 항체 IL6.2E3(로트 RB1811029)	148,937
검출 항체 IL6.2E3(로트 RB1812002)	148,934
검출 항체 IL6.2E3(로트 RB1912002)	148,933

표 2. SPR 분석. SPR(Biacore™ T-200 시스템)을 통해 친화성(포집 mAb의 사전/사후 바이오틴화)이 분석된 MCP-1 Conferma^® ELISA 로트별 포집 및 검출 mAb의 예시. <0.5 nM의 K_D는 높은 친화성을 나타냅니다. Bt = 바이오틴화.<0.5 nM indicates high affinity. Bt = biotinylated.

mAb	mAb 로트	교정 단백질 로트	KD (nM)
MCP-1 포집	RB1811009	046M4767V	0.031
MCP-1 포집	RB1907012	046M4767V	0.023
MCP-1 검출	RB1811010	046M4767V	0.061
MCP-1 검출	RB1907014	046M4767V	0.053
MCP-1 포집 Bt	RB1811010	046M4767V	0.089
MCP-1 포집 Bt	RB1910009	046M4767V	0.072

분석 검사 원칙 및 기술

분석 타당성 검사는 사내 및 연구자의 손 둘 다에서 분석에 의해 수행될 것으로 예상되는 작동 매개변수를 측정합니다. 추천 검사는 문서화^1-4가 잘 되어 있으며, 예를 들면 ICH M10 지침¹이 있습니다. 머크는 Conferma^® ELISA를 검사할 때 그런 지침을 많이 포함합니다(표 3). 모든 검사 목록은 각 분석의 검증 보고서에서 찾을 수 있습니다. 그림 4에 예시 검사 데이터가 나와 있습니다.

표 3. 분석 검사 및 매개변수. Conferma^® ELISA를 위한 분석 검사 기술 설명.

검사	방법	설정된 매개변수
민감도	CV 백분율 및 회수율 백분율이 20% 미만인 표준 곡선의 최하점.	LLOQ/민감도.
시료 평행성	높은 수준으로 내인 단백질이 포함된 희석 매트릭스. 깔끔한 값으로 재계산.	매트릭스 간섭을 나타내는 선형성 백분율.
희석 선형성	알려진 값을 가진 재조합형 단백질을 포함하는 매트릭스의 스파이크 희석 시리즈. 깔끔한 값으로 재계산.	매트릭스 간섭을 나타내는 선형성 백분율.
회수율	알려진 여러 값을 가진 재조합형 단백질을 포함하는 스파이크 매트릭스. 깔끔한 값으로 재계산.	잠재적 매트릭스 간섭을 나타내는 회수율 백분율.
분석 내 CV	단일 플레이트에서 시료 반복 실험을 여러 차례 수행.	플레이트의 웰 간의 분산을 나타내는 CV 백분율.
분석 간 CV	다수의 사용자가 다수의 플레이트에서 시료 반복 실험을 여러 차례 수행.	플레이트 간의 분산을 나타내는 CV 백분율.
교차 반응	매트릭스 내 재조합형 단백질과 관련된 높은 스파이크.	분석 LLOQ의 O.D.가 20% 미만이므로 교차 반응성이 나타나지 않습니다.
내인성 시료 범위	정상 및 질병 상태인 자연 시료.	분석 내인성 동적 범위를 가리킵니다.
매트릭스/시료 수집	시료 시간 및 수집 방법을 검증합니다.	분석에 적절한 매트릭스.
분석 상관관계	동일한 시료를 양쪽 분석에서 수행합니다.	R2는 선형 상관관계를 나타냅니다.

그림 4. 분석 검사 데이터의 예시. (A.) Conferma^® MCP-1 ELISA에 대한 시료 평행성 예시. 희석 및 원래 값으로 재계산된 높은 수준의 표적 단백질이 포함된 내인성 혈청 시료 5종. (B.) Conferma^® TNF-α ELISA의 시료 회수율 검사 예시. 양이 알려진 3가지 재조합형 단백질로 스파이크된 인간 혈청 시료 5종. 회수율은 범위 및 평균값으로 표현됩니다(예를 들어 TNF-α 혈청 = 85%~105%, 평균 = 95%).

로트 간 일관성

ELISA는 반복되는 일회성 사용이자 지속적인 종단 연구의 일부로서 실험실의 실험 전략의 핵심 부분을 구성합니다. 두 경우에서 분석이 장기간에 걸쳐 일관되게 수행되고 있는지 아는 것은 핵심 고려사항입니다. Conferma^® ELISA는 키트를 제조하기 전 로트 간 주요 시약 검사, 내부 참조 물질에 대해 완제품 키트 확인, 장기간 추세 차트에 기록된 데이터가 포함된 내인성 시료 가교로 시작합니다(표 4). 이 검사에서 얻은 데이터의 예시는 그림 1B(표준 곡선 비교/평행성) 및 표 5(시료 로트 간 가교)에서 보여 줍니다.

표 4. 로트 간 일관성을 확인하기 위한 검사 정보. 주요 시약, 표준 물질, 품질 관리, Conferma^® ELISA 키트의 시료 가교에 대한 검사 원칙의 상세 정보.

테스트	정보
주요 시약	순도, 측정된 질량, KD (nM)
표준 물질	표준 곡선 평행성 및 신호(O.D.)
품질 관리	기준선 값의 2 SD 이내에서 수용되는 세 가지 QC의 추세 차트
시료 로트 간 가교	최종 확인, 시료의 80%가 원래 정의된 값의 15% 이내에 속함

표 5. 시료 로트 간 가교. IL-6 Conferma^® ELISA의 로트 가교. 로트 간 분주 및 검사 완료된 15종의 내인성 시료. 80%는 이전 로트 및 원래 값의 15% 안팎이어야 합니다. *결과가 15% 범위의 바깥입니다.

IL-6						분석물	1	2	3	1	2	3	4
시료	평균	중위값	표준편차	%CV	UCL(+2SD)	LCL(-2SD)	2020년 9월 14일	2020년 7월 28일	2020년 7월 27일	2020년 9월 14일	2020년 7월 28일	2020년 7월 27일	2021년 6월 25일
S1	17.67	18.76	1.88	0.11	20.32	15.02	15.50	18.70	18.80	15.47	18.62	18.76	19.10
S2	29.87	31.40	4.48	0.15	34.35	25.39	27.10	31.10	31.40	27.17	30.99	31.46	33.50
S3	27.36	28.58	4.10	0.15	31.46	23.25	25.60	28.70	27.80	25.63	28.58	27.84	30.80
S4	12.20	12.38	1.83	0.15	14.03	10.37	11.40	12.40	12.80	11.40	12.38	12.83	12.20
S5	10.67	10.80	1.60	0.15	12.27	9.07	10.10	10.80	11.10	10.12	10.84	11.07	10.70
S6	31.35	30.20	4.70	0.15	36.05	26.65	28.80	30.20	35.00	28.81	30.14	35.15	30.50
S7	5.66	6.03	0.85	0.15	6.50	4.81	*4.30	*6.60	6.10	*4.26	*6.65	6.03	5.20
S8	2.86	3.00	0.43	0.15	3.29	2.43	3.10	3.00	2.50	3.06	3.06	2.46	2.60
S9	12.28	12.50	1.84	0.15	14.13	10.44	11.50	12.50	13.20	11.48	12.24	12.79	*14.30
S10	10.61	10.70	1.59	0.15	12.21	9.02	10.70	11.20	10.00	10.67	11.16	9.95	11.70
S11	22.59	23.00	3.39	0.15	25.97	19.20	21.10	23.00	23.70	21.13	22.93	23.67	25.60
S12	3.57	3.29	0.53	0.15	4.10	3.03	3.10	*4.30	3.30	3.04	*4.37	3.29	3.20
S13	20.49	20.81	3.07	0.15	23.56	17.41	19.70	21.00	20.80	19.72	20.90	20.81	23.30
S14	6.23	6.30	0.93	0.15	7.16	5.30	6.30	6.50	6.00	6.22	6.42	5.94	*7.60
S15	6.62	6.70	0.99	0.15	7.62	5.63	6.10	7.10	6.70	6.01	7.13	6.70	*8.40
						결과	통과	통과	통과	통과	통과	통과	통과

Conferma^® ELISA 제품

Conferma^® ELISA는 강력한 시료 검출 및 동적 범위를 제공하기 위해 로트별로 설계 및 검사됩니다. 이를 달성하기 위해 사용되는 방법 및 프로토콜은 현재 산업에서 적용되고 있는 가장 최신 방법 및 프로토콜 중 일부입니다. 그 결과는 전달을 위해 설계된 분석입니다.

각 분석에는 두 가지 주요 문서인 분석의 검사 과정을 자세히 알려주는 검증 보고서와 아래 링크된 각각의 제품 페이지에서 찾을 수 있는 로트별 시험성적서가 있습니다. 이러한 페이지에서 각 ELISA에 대한 프로토콜도 찾을 수 있습니다.

Conferma^® ELISA 공정의 상세 정보에 대해 더 자세히 알아보려면 이 웨비나를 통해서 시청할 수도 있습니다.

연구 목적 외 사용 금지. 진단 절차에 사용 금지.

참고문헌/추가 자료

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3. O’Hara DM, Theobald V, Egan AC, Usansky J, Krishna M, TerWee J, Maia M, Spriggs FP, Kenney J, Safavi A, et al. 2012. Ligand Binding Assays in the 21st Century Laboratory: Recommendations for Characterization and Supply of Critical Reagents. AAPS J. 14(2):316-328. https://doi.org/10.1208/s12248-012-9334-9

4. King LE, Farley E, Imazato M, Keefe J, Khan M, Ma M, Pihl KS, Sriraman P. 2014. Ligand Binding Assay Critical Reagents and Their Stability: Recommendations and Best Practices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16(3):504-515. https://doi.org/10.1208/s12248-014-9583-x