โปรโตคอล ribonucleoprotein (RNP) โดยใช้ sgRNA สังเคราะห์และโปรตีน Cas9

แอปพลิเคชันการแก้ไขจีโนมที่ใช้ CRISPR RNP

แม้ว่าระบบ CRISPR สามารถส่งไปยังเซลล์ผ่านพลาสมิดแต่การแนะนำโดยตรงของ Cas9 RNP จะเสริมสร้างและขยายการใช้เทคโนโลยีการปรับเปลี่ยนพันธุกรรม CRISPR โดยการกำจัดความเป็นไปได้ของการรวมดีเอ็นเอพลาสมิดเข้ากับจีโนมโฮสต์ คอมเพล็กซ์ RNP เสนอการแก้ไขยีนที่เร็วขึ้นเนื่องจากมีการใช้งาน nuclease ทันทีในเซลล์และคอมเพล็กซ์ลดลงอย่างรวดเร็วและล้างทำให้กิจกรรมการแก้ไขสั้นๆ การลดเวลาของ RNP ที่มีอยู่ในเซลล์จะทำให้ผลกระทบที่ไม่ตรงตามเป้าหมายลดลง

รูปที่ 1 แผนภาพวงจรของ CRISPR ระบบหนึ่งส่วนและสองส่วนที่มีโปรตีน Cas9 แสดงให้เห็นถึงองค์ประกอบของ ribonucleoprotein (RNP) หลังจากที่มีการแบ่งเส้นสองเส้นเกิดขึ้นสองเส้นทางการซ่อมแซมที่เป็นไปได้จะดำเนินการโดยเครื่องจักร DNA ของเซลล์ ; การเชื่อมต่อปลายที่ไม่เป็นที่ยอมรับ (NHEJ), การก่อตัวของดัชนีหรือการซ่อมแซมตามหลักโฮโลยี (HDR) สำหรับการแทรกเป้าหมายหรือการเคาะอิน

โปรโตคอลโดยละเอียด

คู่มือสังเคราะห์ของเราเข้ากันได้กับแอปพลิเคชันการแก้ไขยีนที่หลากหลาย ไม่ว่าคุณจะต้องการแนวทางการใช้งานทั่วไปนิวเคลียสและการฉีดจุลภาคของตัวอ่อนการแก้ไขเซลล์ T หรือโปรโตคอล IPSC นอกจากนี้คุณยังสามารถค้นหาความช่วยเหลือเกี่ยวกับการประเมินประสิทธิภาพการดักฟังแบบปลายทางการแยกและการคัดกรองแบบโคลนและการแก้ไขปัญหา

การแก้ไขเซลล์ T หลักโดยใช้ RNP

การทดลองแก้ไขจีโนมที่ใช้ ribonucleoprotein (RNP) ไม่เคยง่ายไปกว่าการใช้ RNAs คู่มือสังเคราะห์ Cigma-Aldrich ® และโปรตีน Cas9 อย่างไรก็ตามเซลล์บางเซลล์อาจแก้ไขได้ยากกว่าเซลล์อื่น เราได้ตรวจสอบน้ำยาและโปรโตคอลของเราอย่างกว้างขวางเพื่อทำงานในการใช้งานที่ท้าทายที่สุดรวมถึงในเซลล์ T หลักซึ่งมีความท้าทายที่สำคัญจำนวนมากที่ต้องเอาชนะเมื่อพยายามที่จะเคาะหรือเคาะโครงสร้างหรือยีน อย่างไรก็ตามด้วย sgRNA การแก้ไขในเซลล์ T หลักของมนุษย์ที่มีประสิทธิภาพและความจำเพาะที่เกินระบบนำทางสองส่วนสามารถทำได้ (รูปที่  2 ของแผ่นข้อมูลด้านล่าง) ทั้งในเซลล์ T หลักและ PBMCs เพื่อให้แน่ใจว่า Sigma-Aldrich^® sgRNA scan ได้รับการแนะนำให้ใช้เป็น Nickases ที่มีความเฉพาะเจาะจงสูงและ Cas9 Nickase หรือเป็นโปรตีน SpCas9 ในไซต์เดียวเพื่อให้ได้ 1 การกระเด็นของยีน PD-9 ที่สมบูรณ์ตามที่วัดโดย 1 นิพจน์ PD-3 และ NGS (รูปที่  2 จากเอกสารข้อมูลด้านล่าง) sgRNA สามารถออกแบบได้อย่างรวดเร็วสำหรับยีนใดๆเป็น RNA เป้าหมายเดียวหรือเป็นส่วนหนึ่งของระบบ nickase ที่จับคู่เหมาะสำหรับเซลล์มนุษย์หลากหลายประเภทรวมถึง T-cells หลัก CAS nucleases เมื่อส่งมอบในรูปแบบโปรตีนก่อนคอมเพล็กซ์กับ RNA คู่มือการแก้ไขเดียว (gRNA) แทนที่จะเข้ารหัสบนพลาสมามิดช่วยให้นักวิจัยสามารถหลีกเลี่ยงปัจจัยที่จำกัดในอดีตของการใช้ CRISPR ในขอบเขตการรักษาของผลกระทบนอกเป้าหมายที่มีประสิทธิภาพต่ำและการตอบสนองของเซลล์ที่ไม่พึงประสงค์ต่อดีเอ็นเอต่างประเทศ เมื่อคุณต้องการความมั่นใจ Sigma-Aldrich^® sgRNA เป็น RNA ที่เป็นแนวทางเดียวที่ได้รับการสนับสนุนอย่างเต็มที่จากการรับประกันประสิทธิภาพ 100% –กำหนด  ลำดับ Dan dcustomed ไว้ล่วงหน้า

รูปที่ 2 การแก้ไขด้วยระบบ RNP Nickase ที่มีโดเมนการตัดที่ใช้งานอยู่เพียงโดเมนเดียวจากนั้นส่งมอบด้วย RNA คู่มือ proximal ในคู่ช่วยให้สามารถแบ่งตัวที่ติดอยู่ได้อย่างแม่นยำและให้การแก้ไขจีโนมเฉพาะและมีประสิทธิภาพในประเภทเซลล์ที่ยากต่อการแก้ไข

การแก้ไขยีนประสิทธิภาพสูงที่ได้รับการพิสูจน์แล้วในตัวอ่อนเมาส์

การสร้างแบบจำลองเมาส์เป็นกระบวนการที่ใช้แรงงานมากและมีราคาแพงแต่เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการวิจัยขั้นพื้นฐานในการทำความเข้าใจสุขภาพและโรค ประสิทธิภาพ SIGMA-Aldrich ® sgRNA เป็น ระดับสูงสุดสำหรับวิศวกรรมจีโนมในแอปพลิเคชันตัวอ่อนของเมาส์โดยการเปรียบเทียบ sgRNA ของเรากับผู้ให้บริการชั้นนำอื่นๆที่ไซต์จีโนมิกหลายแห่งในตัวอ่อนของเมาส์    

การเปรียบเทียบหลายครั้งในแต่ละสถานที่โดยเปรียบเทียบกันแสดงให้เห็นถึงความแตกต่างในประสิทธิภาพการแก้ไขระหว่างเป้าหมาย sgRNA ที่เหมือนกันระหว่าง Sigma-Aldrich^® sgRNA และผู้ให้บริการชั้นนำอื่นๆ การทดลองที่เกิดขึ้นควบคู่กัน   ไปโดยสิ่งอำนวยความสะดวกหลักที่เป็นอิสระและโดดเด่นของเมาส์แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่เหนือกว่าของคู่มือเดียว Sigma-Aldrich ® ในด้านประสิทธิภาพการตัด นอกจากนี้ยังไม่มีการเพิ่มขึ้นของ  ความเป็นพิษต่อความสามารถในการรอดชีวิตของตัวอ่อน โดยรวมแล้ว ข้อมูลแสดงให้เห็นว่า sgRNA ที่ใช้งานได้สูงและบริสุทธิ์ของเราให้การแก้ไขยีนที่เหนือกว่าในการทดลองที่ดำเนินการโดยโรงงานอิสระเมื่อเทียบกับคู่แข่งที่เป็นอิสระจาก microinjection หรือ electroporation ของตัวอ่อน

รูปที่ 3 การแก้ไขยีนในตัวอ่อนของเมาส์เป็นกระบวนการที่ยาวนานแต่การแก้ไขที่ใช้ RNP ด้วย CRISPR จะช่วยลดความซับซ้อน สามารถสร้างรุ่นของเมาส์ได้อย่างรวดเร็วสำหรับชิ้นงานเกือบทุกชนิด sgRNA สังเคราะห์ของเราเหมาะสำหรับการฉีดขนาดเล็กและการไหลของตัวอ่อน

สินค้าที่เกี่ยวข้อง

Table 1: Cas9 Protein Products

ตารางที่ 2 ผลิตภัณฑ์อื่นๆที่เกี่ยวข้อง

การแก้ไขปัญหา

หากไม่มีการตรวจสอบการตัดและมีเหตุผลที่สงสัยว่ามีข้อบกพร่องในการทดลองเกิดขึ้นเนื่องจากความผิดพลาดข้อควรพิจารณาต่อไปนี้อาจช่วยในการแก้ไขปัญหาการทดลองได้