Antisense Oligonucleotides

บทความนี้สรุปกลไกทั่วไปของการปรับยีน antisense และที่สำคัญกว่านั้นข้อควรพิจารณาที่จะคำนึงถึงเมื่อออกแบบ oligonucleotide antisense (ASO) หลังจากหลายทศวรรษของการวิจัยไม่มีกฎการออกแบบที่ยากและรวดเร็วมันยังคงเป็นการทดลองและข้อผิดพลาด อย่างไรก็ตามมีแนวทางที่ต้องปฏิบัติตามซึ่งจะทำให้กระบวนการสามารถจัดการได้มากขึ้น

Section Overview

• Design Assistance
• กลไกการมอดูเลต
• Design Considerations
• โครงสร้าง
• Quality Considerations
• Delivery & Toxicity
• สรุป
• ข้อมูลอ้างอิง

Design Assistance

ต้องการความช่วยเหลือในการออกแบบ ASO หรือไม่สามารถหาการแก้ไขในโปรแกรมตั้งค่าการสั่งซื้อออนไลน์ได้ใช่หรือไม่ ทีมบริการด้านเทคนิคของเราสามารถให้ความช่วยเหลือได้ โปรดส่งคำขอไปที่ oligotechserv@sial.com

กลไกการมอดูเลต

การมอดูเลตยีนแบบดั้งเดิมของ ASO (โดยปกติจะมีความหมายเหมือนกันกับการปิดเสียงหรือการควบคุมการแสดงออกของยีน แต่มันสามารถใช้เพื่อปรับปรุงการแสดงออกของยีนและอย่างน้อยหนึ่งกรณีมันถูกแสดงให้เห็นว่านำไปสู่การเพิ่มระเบียบของการแสดงออกของยีน) เป้าหมาย mRNA และสามารถเกิดขึ้นในนิวเคลียสหรือ cytoplasm ในนิวเคลียส (pre-mRNA เป็นเป้าหมาย) การปรับมักจะทำงานโดยการเปลี่ยนเส้นทาง polyadenylation¹การเปลี่ยนแปลงการเชื่อมต่อเหตุการณ์²หรือการเชื่อมต่อระหว่าง cleaving internucleotide พันธบัตร³ทั้งหมดที่เกิดขึ้นในระหว่างการเจริญเติบโตของ mRNA (รูปที่ 1) ใน cytoplasm (mRNA ผู้ใหญ่เป็นเป้าหมาย) การปรับมักจะทำงานโดยการเปลี่ยนแปลงการแปลโดยไม่ต้องถ่มน้ำลาย⁴ หรือถ่มน้ำลาย³ซึ่งทั้งสองเกิดขึ้นก่อน/ระหว่างการแปล (รูปที่ 2)

รูปที่ 1 กลไกการปรับยีนที่ใช้ ASO ในนิวเคลียส ในกรณีของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม gDNA ในนิวเคลียสจะถูกแปลงเป็น pre-mRNA ASO จากภายนอกในนิวเคลียส hybridizes A) ไปยังสัญญาณ polyadenylation 3 ' มากที่สุดใน pre-mRNA และบล็อก polyadenylation ที่เว็บไซต์นี้จึงเปลี่ยนเส้นทางไปยังเว็บไซต์อื่นต้นน้ำซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีน¹ B) ไปยังเว็บไซต์ประกบกันจึงป้องกันการชุมนุมที่เหมาะสมของ spliceosome, ซึ่งนำไปสู่การข้าม Exon และการแสดงออก^{ที่ดีขึ้นของยีนโรค 2} (ไม่ถือว่าเป็น ASO จริงโดยหลายๆคนเหล่านี้มักจะเรียกว่าการสลับขั้ว oligonucleotides [SSO] หรือโดยทั่วไปแล้วการปิดกั้น steric oligonucleotides [SBO]) C) Exon หรือ Intron (ในกรณีนี้เป็นบทนำ) จึงนำไปสู่การแตกแยกโดย RNase H³ ในกรณีส่วนใหญ่แม้ว่าจะมีการควบคุมที่เข้มงวดเงียบหรือเปลี่ยนแปลงไปอย่างมีนัยสำคัญแต่การประมวลผลบางอย่างของ mRNA ที่ไม่ได้รับผลกระทบก็มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นตามด้วยการส่งออก mRNA ที่เป็นผู้ใหญ่ไปยัง cytoplasm S = ลำดับสัญญาณ Polyadenylation (แม้ว่าจะแสดงเพียงหนึ่งรายการเท่านั้นที่นี่แต่อาจมีมากกว่าหนึ่งรายการต่อหนึ่งทรานสคริปท์)

รูปที่ 2 กลไกการปรับยีนที่ใช้ ASO ใน cytoplasm ในกรณีของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม gDNA ในนิวเคลียสคือ 1 จะถูกแปลงเป็น pre-mRNA 2) pre-mRNA จะถูกประมวลผล (หมวก 5 ' และ 3 ' poly [a] หางจะถูกเพิ่ม) และ spliced (อินทรอนจะถูกลบออก) เพื่อผลิต mRNA ที่เป็นผู้ใหญ่และ 3) mRNA ที่เป็นผู้ใหญ่จะถูกส่งออกไปยัง cytoplasm ASO ข้ามพันธุ์กับ mRNA ผู้ใหญ่ใน cytoplasm และเงียบ (ลด) การแสดงออกของยีนโดยก) การเปลี่ยนแปลงการแปลในกรณีนี้การยับยั้งการแปลโดยการขัดขวางการประกอบ ribosomal ที่ฝา 5 '⁴ (มักจะไม่ถือว่าเป็น ASO ที่แท้จริงนี่เป็นตัวอย่างของ SBO ทั่วไป) หรือ B) ความแตกแยกโดย RNase H (โดยเฉพาะ RNase H1 ในมนุษย์)³ ในกรณีส่วนใหญ่แม้ว่าจะมีการปรับลดลงอย่างมากแต่การแปลก็ยังคงเกิดขึ้น

ASO รับรู้และเชื่อมโยงกับเป้าหมาย mRNA โดยการจับคู่ฐาน Watson-Crick ASO ที่นำไปสู่การแตกแยกของ mRNAs เป้าหมายโดย RNase H (ไม่ว่าจะอยู่ในนิวเคลียสหรือ cytoplasm³) ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางเพื่อวัตถุประสงค์ในการวิจัยและการรักษาและดังนั้นจึงเป็นที่เข้าใจดีที่สุดในแง่ของกลไกการปรับ การใช้แมกนีเซียมไอออนเป็นโคแฟกเตอร์ RNase H (โดยเฉพาะ RNase H1 ในมนุษย์) จะแยกเส้นใย mRNA ใน mRNA: ดีเอ็นเอ heteroduplex ผ่านการย่อยสลายของพันธะ internucleotide (phosphodiester)⁵ หลังจากการแตกแยก ASO ยังคงเหมือนเดิมในขณะที่พันธบัตรน้องสาวเก่าตอนนี้ฟรี 3 '-hydroxyl และ 5 '-phosphate กลุ่มบนชิ้นส่วน 5 ' และ 3 ' ตามลำดับของ mRNA ที่ลดลง

Design Considerations

โดยหลักการแล้วการปิดเสียงยีนควรทำได้ง่ายเพียงเลือกลำดับภายใน mRNA เป้าหมายสั่งซื้อ ASO เสริมที่มีส่วนผสมของวัตสัน - คริค - เบส - คู่จากผู้ขายแนะนำให้เข้าสู่ระบบภายใต้การศึกษา (ทั้ง ในหลอดทดลอง หรือ ในร่างกาย) และสังเกตผลที่คาดว่าจะได้รับจากผู้รายงานที่เกี่ยวข้อง อย่างไรก็ตามมีข้อควรพิจารณามากมายที่ต้องคำนึงถึงการออกแบบ ASO ที่ประสบความสำเร็จ

Hybridization Site

ตามกฎของการจับคู่ฐาน Watson-Crick ASO ควรเชื่อมโยงกับภูมิภาคใดๆของลำดับ mRNA เป้าหมาย อย่างไรก็ตาม mRNAs จะพับเข้าไปในโครงสร้างรองและแม้แต่โครงสร้างขั้นที่สามซึ่งอาจขัดขวางการผสมข้ามพันธุ์ ASO ดังนั้นควรเลือกพื้นที่แบบไม่พับของ mRNAs เป็นไซต์การผสมข้ามพันธุ์ มีวิธีการในห้องปฏิบัติการเปียกเช่นการทำแผนที่ RNase H ที่มีประโยชน์ในการทำนายเว็บไซต์ที่สามารถเข้าถึงได้⁶แต่สถานที่ที่ดีในการเริ่มต้นคือการลองใช้อัลกอริทึมการพับ RNA แบบคาดการณ์เช่น mfold

เมื่อระบุพื้นที่ที่ไม่พับแล้วการพิจารณาขั้นที่สองควรเป็นกรณีที่พื้นที่ทำหน้าที่เป็นจุดเชื่อมโยงสำหรับ spliceosomes, ribosomes, โปรตีนหรือส่วนประกอบ macromolecular อื่นๆ ในอดีตหมวก 5 ', codon เริ่มต้น, 3 ' ภูมิภาคที่ไม่ได้แปล/หาง polyA ได้รับการเลือกเว็บไซต์ที่ดี⁷ แม้ว่า ASO จะไม่สามารถเปิดใช้งาน RNase H ได้แต่ก็อาจทำให้เกิดการปิดเสียงเนื่องจากจะขัดขวางเครื่องจักรที่จำเป็นสำหรับการเติบโตหรือการแปล mRNA

Nuclease Degradation

ในร่างกาย และ ในหลอดทดลอง, ASO ดีเอ็นเอพื้นเมืองทั้งหมดจะได้รับการแสดงผลอย่างรวดเร็วไร้ประโยชน์โดยกิจกรรม nuclease ในร่างกายแม้ว่า endonucleases และ exonucleases ทั้งสองอาจนำไปสู่การย่อยสลาย⁸exonucleases ดูเหมือนจะทำส่วนใหญ่ของความเสียหาย^9,10 เพื่อให้มีประสิทธิภาพ ASO ทั้งหมดต้องมีการปรับเปลี่ยนทางเคมีเพื่อต่อต้านการเสื่อมสภาพของนิวไคลด์ แม้ว่าจะมีตัวสังเคราะห์กรดนิวคลีอิกจำนวนมากสำหรับการปรับเปลี่ยน ASOS^{5,11 แต่}ในที่นี้จะ  มีการสำรวจเฉพาะผู้ที่เป็นส่วนหนึ่งของการปรับเปลี่ยนมาตรฐาน OU เท่านั้น (ตารางที่ 1)

สามภูมิภาคของ ASO อาจมีการปรับเปลี่ยน (การเชื่อมโยงระหว่างอินเทอร์นาคลีโอไทด์น้ำตาลและฐาน) และในส่วนที่ตามมาทั้งหมดการปรับเปลี่ยนจะถูกจัดประเภทตามผลหลักของพวกเขาแม้ว่าหลายคนจะมีผลมากกว่าหนึ่งเช่นการปรับเปลี่ยนผลหลัก X: ปรับปรุงความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพันผลรอง: ลดผลกระทบที่เป็นอันตรายจากการกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (โฟกัสของบทความนี้จะยังคงอยู่ในผลหลัก)

ฟอสฟอรัส การดัดแปลงนี้เป็นหนึ่งในไม่กี่คนที่ถือว่าเป็นรุ่นแรก PS-ASO มีความทนทานต่อนิวไคลด์และดังนั้นจึงมีอายุการใช้งานครึ่งชีวิตของพลาสมาที่ยาวนานกว่าเมื่อเทียบกับ DNA ASOS^{9 ทั้งหมด} นอกจากนี้ยังมีประจุลบที่เป็นกระดูกสันหลังซึ่งช่วยให้การเข้าสู่เซลล์ PS-ASO เข้าสู่เซลล์¹¹ได้ง่ายขึ้น ที่น่าสนใจ PS ดูเหมือนจะมีผลกระทบมากขึ้นในการขนส่งและการเข้าสู่เซลล์กว่าที่จะทำในความต้านทานนิวไคลด์¹²

อย่างไรก็ตาม PS-ASO ไม่ได้รับการป้องกันอย่างสมบูรณ์จากนิวเคลียสได้ลดการผสมข้ามไปยัง mRNAs เป้าหมาย (ดูส่วนความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพัน) และต้องได้รับการบริหารอย่างต่อเนื่องในปริมาณมากเพื่อรักษาการปรับ¹¹ นอกจากนี้ PS สามารถโต้ตอบกับโปรตีนในร่างกายและดังนั้นจึงนำไปสู่ผลข้างเคียงเชิงลบรวมถึงกิจกรรมของระบบภูมิคุ้มกัน¹¹

เมธิลอาร์เอ็นเอ การดัดแปลงนี้เป็นหนึ่งในไม่กี่คนที่ถือว่าเป็นรุ่นที่สอง เมื่อใช้ร่วมกับ PS ใน ASO พบว่า 2 '-OME-RNA ได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นตามประโยชน์ของ PS เพียงอย่างเดียว (เช่นความต้านทานนิวไคลด์ที่เพิ่มขึ้นพลาสม่าครึ่งชีวิตและการดูดซึมเนื้อเยื่อ¹¹)

Methoxyethyl RNA. อนุพันธ์ของ 2 '-me-rna, 2 '-O-methoxyethyl (2'-moe) ได้รับความนิยมในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาหลังจากที่ได้รับการรวมไว้ในยาที่ได้รับการอนุมัติหลาย 2 คล้ายกับการปรับเปลี่ยน ribonucleotides 2 อื่นๆ 2 '-MOE ส่งผลให้เสถียรภาพดูเพล็กซ์เพิ่มขึ้นเมื่อจับคู่กับเป้าหมาย RNA

Fluoro RNA. แทนที่กลุ่ม 2 '-hydroxyl ใน RNA ด้วยฟลูออรีนอย่างมากเพิ่มอุณหภูมิหลอมละลายเสถียรภาพทางเคมีและความต้านทานต่อนิวเคลียส

การกระตุ้นภูมิคุ้มกัน

ดีเอ็นเอของแบคทีเรียมีความถี่ที่สูงขึ้นของ CPG (Cytosine-phosphodiester bond-guanine) dinucleotides ที่ขาด methylation มากกว่าดีเอ็นเอ vertebrate นี่เป็นหลักเพราะ CPG dinucleotides มีการขีดเส้นใต้ในจีโนมกระดูกสันหลังและร้อยละ 80 ของพวกเขามีป้ายกำกับด้วยกลุ่มเมธิล¹³ เนื่องจากลวดลาย CPG ในแบคทีเรียจะกระตุ้นการทำงานของเซลล์ B, เซลล์ NK, โมโนไซต์และไซโตไคน์ในขณะที่ลวดลายของกระดูกสันหลัง CPG ไม่ได้มีแนวโน้มว่าจะมีอย่างน้อยหนึ่งวิธีที่ระบบภูมิคุ้มกันรู้จักการติดเชื้อแบคทีเรีย¹³ ASO ที่มี CPG ที่ไม่มี methylated (CpsG: cytosine-phosphorothioate bond-guanine มีศักยภาพมากขึ้น¹⁴) แรงจูงใจกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันในลักษณะที่คล้ายกับ DNA ของแบคทีเรียและอาจมีหน้าที่รับผิดชอบต่อผลกระทบที่รายงานจากการศึกษา antisense ในช่วงต้น

เพื่อหลีกเลี่ยงการกระตุ้นภูมิคุ้มกันการออกแบบ ASO ขาดรูปแบบ CPG/CpsG ถ้าเป็นไปได้หรืออย่างน้อยผู้ที่ขาดบรรทัดฐานต่อไปนี้ซึ่งก่อให้เกิดการตอบสนองภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งที่สุด¹⁴:

• purine-purine-CPG-pyrimidine-pyridmidine

เนื่องจากอาจเป็นเรื่องยากที่จะหลีกเลี่ยงเนื่องจากลักษณะที่สมบูรณ์ของลำดับการเลือกไซต์เป้าหมายขั้นตอนที่ดีที่สุดต่อไปคือการแทนที่ cytosine ใน CPG/CpsG ด้วย 5 '-methylcytosine (ตารางที่ 2) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าลดการกระตุ้นภูมิคุ้มกันอย่างมีนัยสำคัญ¹⁵

ความยาวซีเควนซ์

ความยาวที่เหมาะสมมักจะมาจาก 12 ถึง 28 ฐาน⁶ ลำดับที่สั้นกว่า 12 ฐานจะเพิ่มความน่าจะเป็นของการผสมพันธุ์นอกเป้าหมายในขณะที่ลำดับที่ยาวกว่า 25 ฐานจะเพิ่มโอกาสในการรับเซลล์ที่ลดลง⁶

การเติมเต็มตัวเอง

ควรตรวจสอบ ASO สำหรับโครงสร้างรองและการสร้างตัวทำให้เป็นตัวทำให้เป็นตัวทำให้เป็นตัวทำให้เกิด oligonucleotide dimmer เนื่องจากอาจรบกวนการผสมข้ามพันธุ์กับลำดับไซต์เป้าหมาย หากเป็นไปได้ให้ออกแบบ ASO ให้มีโครงสร้างรองที่อ่อนแอที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้รวมทั้งไม่มีการสร้างตัวหรี่ เครื่องคำนวณลำดับ oligonucleotide OligoEvaluator ™ ของเราช่วยให้สามารถกำหนดโครงสร้างการขึ้นรูปด้วยตนเองเหล่านี้ได้อย่างรวดเร็ว

G-Quartet Structures

ASO ที่มีนิวคลีโอไทด์ C หรือ G สองตัวหรือมากกว่าสามารถสร้างโครงสร้างที่ผิดปกติซึ่งอาจก่อให้เกิดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์นอกเป้าหมาย ที่พบมากที่สุดและการศึกษาคือความยาวของฐาน G ซึ่งสามารถนำไปสู่การก่อตัวของ G-quartets¹⁶ สี่เหล่านี้ได้รับการแสดงให้เห็นว่าผูกกับโปรตีนรวมทั้งปัจจัยการถอดสคริปต์¹⁷ซึ่งอาจเลียนแบบและดังนั้นจึงรบกวนการทำงานของ antisense

หากเป็นไปได้ให้ออกแบบ ASO ที่ไม่มีโพลีจีเหล่านี้เพื่อหลีกเลี่ยงการก่อตัวของสี่แผนภูมิเหล่านี้ อีกครั้งเนื่องจากสิ่งนี้อาจไม่เป็นไปได้ขั้นตอนที่ดีที่สุดต่อไปคือการแทนที่ guanine ด้วย 7 deaza-DG (ตารางที่ 3) ซึ่งจะบล็อกการก่อตัวของสี่¹⁸

Functional Motifs

การวิเคราะห์ทางสถิติของการทดลอง PS-ASO พบว่ารูปแบบต่อไปนี้:

• CCAC
• TCCC
• ACTC
• GCCA
• CTCT

มีความสัมพันธ์กับประสิทธิภาพการต่อต้านการรู้สึกที่ดีขึ้นในขณะที่ลวดลายเหล่านี้:

• GGGG
• ACTG
• AAA
• ทีเอ

ลดกิจกรรม antisense¹⁹ พบว่ากิจกรรม RNase H เป็นลำดับที่อิสระ²⁰ดังนั้นจึงเชื่อว่าลวดลายที่เพิ่มขึ้นจะนำไปสู่ความเสถียรทางอุณหพลศาสตร์ที่เพิ่มขึ้นของ mRNA: ASO heteroduplex ผ่านความต้องการของการจับคู่ฐาน GC Watson-Crick

Binding Affinity

ดังที่ได้กล่าวไปแล้วเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งที่จะต้องระบุไซต์ภายใน mRNA เป้าหมายที่ไม่มีรอยพับและเพื่อให้แน่ใจว่า ASO ยังไม่มีความซับซ้อนในตนเองที่เป็นอันตราย อย่างไรก็ตามข้อควรพิจารณาเหล่านี้เพียงอย่างเดียวยังไม่เพียงพอที่จะทำให้แน่ใจว่าการผสมข้ามพันธุ์ถูกต้อง ปัจจัยต่างๆเช่น PS สามารถลดความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพัน ASO สำหรับไซต์เป้าหมาย¹¹ซึ่งจะช่วยลดประสิทธิภาพในการต่อต้านความรู้สึก

การปรับเปลี่ยน ASO รุ่นที่สามไม่เพียงแต่จะทนต่อนิวไคลด์แต่ยังช่วยปรับปรุงความสัมพันธ์ที่มีผลผูกพัน กรดนิวคลีอิกล็อค (ตารางที่1) ที่มีโครงสร้างวงแหวนที่จำกัดมีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการปรับปรุงความสัมพันธ์และประสิทธิภาพของ ASO (การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิหลอมละลายต่อการเติมโมโนเมอร์แตกต่างกันไปตั้งแต่ + 4 ถึง + 11°C เมื่อเทียบกับดีเอ็นเอพื้นเมืองเพียง²¹)

โครงสร้าง

เพื่อให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับลำดับ ASO ตัวอย่างของยาต้านอาการหลายชนิด (ซึ่งมักเป็นวัตถุประสงค์หลักในการศึกษาวิจัยต่อต้านการรับรู้) ที่ได้รับการอนุมัติหรืออยู่ในการทดลองทางคลินิกมีให้ที่นี่ ยาเหล่านี้เป็นตัวอย่างของ (หรือคาดว่าจะอยู่ในกรณีของผู้ที่อยู่ในการทดลองทางคลินิก) ผลลัพธ์ที่ต้องการทั้งหมดเมื่อพูดถึง antisense: การออกแบบที่ดีกลไกการจัดส่งที่มีอยู่และการปรับที่มีประสิทธิภาพ ผลลัพธ์เดียวกันมีความสำคัญต่อความสำเร็จของการทดลองการวิจัย (ASO ของเรามีไว้สำหรับในหลอดทดลองและในรูโวสัตว์ [ ใช้วิจัยเท่านั้น ])

รุ่นแรก ในปี 1998 Fomiversen (ชื่อแบรนด์ Vitravene) เป็นยา antisense ที่ได้รับการอนุมัติครั้งแรก มันถูกใช้ในการรักษา tcytomegalovirus retinitis (CMV) ในผู้ป่วยที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องรวมทั้งผู้ที่มีโรคเอดส์ ยาถูกส่งมอบ โดยการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ ASO 21 เมอร์ที่มีการเชื่อมต่อ PS internucleotide ทั้งหมดมีลำดับต่อไปนี้:

• G * C * G * T * T * T * T * G * C * T * C * T * T * C * T * T * C * T * T * G * C * G

            ○     * = PS

และทำงานโดยการยับยั้งการแปล mRNA ที่ถอดสคริปต์จากยีน CMV UL123²² ในที่สุดก็ถูกถอนออกจากตลาดเนื่องจากการพัฒนา HAART (การรักษาด้วยยาต้านไวรัสที่ใช้งานสูง) เพื่อรักษา HI Vreduced จำนวนเคส CMV ร้อยละ 75 และทำให้ยอดขายไม่ดี

เนื่องจาก ASO เฉพาะ PS ไม่ได้รับการป้องกันอย่างสมบูรณ์จากนิวเคลียสได้ลดการผสมข้ามไปยัง mRNA เป้าหมายต้องได้รับการบริหารอย่างต่อเนื่องในปริมาณมากเพื่อรักษาการปรับและสามารถโต้ตอบกับโปรตีนซึ่งอาจนำไปสู่ผลข้างเคียงเชิงลบ¹¹โครงสร้างรุ่นแรกถูกทิ้งไว้ในท่อ R & D เป็นส่วนใหญ่

รุ่นที่สอง ในปี 2013 Mipomersen (ชื่อแบรนด์ Kynamro^®) กลายเป็นยาต้านการรับรู้ที่ได้รับการอนุมัติเป็นครั้งที่สอง   ยาถูกส่งมอบ โดยการฉีดเข้าใต้ผิวหนัง ASO 20 เมอร์ที่มีการเชื่อมต่อ PS internucleotide ทั้งหมดมีลำดับต่อไปนี้:

• G * MC * MC * MU* MC * A * G * T * MC * T * T * G * MC * T * T *MC * G * MC * A * MC * MC

            ○     ขีดเส้นใต้ = 2 '-O-MOE-RNA (MOE คือ 2 methoxyethyl)

            ○     m = methyl เช่น 5 me-DC และ 5 me-U

            ○     * = PS

และทำงานโดยการยับยั้งการแปล apolipoprotein B-2 mRNA 100²³ มีความเสี่ยงที่จะ เกิดความเสียหายแก่ผู้ให้บริการดังนั้นยาจะต้องเป็นส่วนหนึ่งของแผนการจัดการความเสี่ยง

โมเลกุลแอนติเซนส์รุ่นที่สองเช่น Mipomersen ได้รับการออกแบบด้วยการกำหนดค่า gapmer 5²⁴ ซึ่งสามารถดูได้ตามลำดับด้านบน: ปีก 5 ' และ 3 ' ของฐาน 5 (แก้ไขด้วยการปรับเปลี่ยนน้ำตาลที่ทนต่อนิวไคลน์/เพิ่มความผูกพัน) และช่องว่างกลางของ deoxyribonucleotides มาตรฐาน 10 (ไม่มีการปรับเปลี่ยนน้ำตาล) ที่ช่วยให้ RNase H ผูกพัน¹¹

ในกรณีนี้ปีกประกอบด้วย 2 '-O-MOE-RNA (MOE เป็น 2 methoxyethyl) การเปลี่ยนแปลงของการปรับเปลี่ยน 2 '-O-methyl RNA

รุ่นที่สาม ในปี 2017 Miravirsen (SPC3649) อยู่ในการทดลองทางคลินิกระยะที่ II²⁵ มันถูกทดสอบว่าเป็นการรักษา โรคตับอักเสบซี (HCV)  ยาถูกส่งมอบ โดยการฉีดเข้าใต้ผิวหนัง ASO 15 เมอร์ที่มีการเชื่อมต่อระหว่าง PS กับ PS internucleotide ทั้งหมดมีลำดับต่อไปนี้²⁶:

• C* C *A* T *T * G * T *C * A * C* A * C* T *C * C

            ○     ขีดเส้นใต้ = LNA

            ○     * = PS

และทำงานโดยการผสมกับ miRNA มนุษย์ miR 122 ซึ่งจะช่วยป้องกันไม่ให้ miR 122 นำ Argonaute ไปยังภูมิภาค 5 '-UTR ของ HCV RNA ซึ่งโดยปกติแล้วจะผูกไว้และป้องกันการเสื่อมสภาพของนิวไคลด์²⁵ ดังนั้น Miravirsen จึงอนุญาตให้ทำลาย RNA ไวรัส

แม้ว่า Miravirsen จะไม่ใช่ ASO แบบดั้งเดิมเนื่องจากมีเป้าหมาย miRNA และดังนั้นจึงนำไปสู่การเสื่อมสภาพของ mRNA โดยอ้อมแต่ก็เป็นหนึ่งในตัวอย่างที่ดีที่สุดของโครงสร้างรุ่นที่สามที่มี LNA ดังนั้นจึงรวมอยู่ที่นี่

Target Check

ลำดับ ASO สุดท้ายที่ไม่ได้รับการแก้ไขควรจะใส่ผ่านทาง Blas tsearch เพื่อให้แน่ใจว่าการผสมข้ามเป้าหมายใดๆ - โดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่มี - จะไม่รบกวนกับกิจกรรม antisense หรือนำไปสู่ความเป็นพิษที่ยอมรับไม่ได้

Quality Considerations

สำหรับ ใน การทดลองสัตว์ vivo เราขอแนะนำให้ ASO ได้รับการ ทำให้บริสุทธิ์ในร่างกายด้วยการแลกเปลี่ยนเกลือ (แทนที่ไอออนแอมโมเนียม ที่เป็นพิษจากการสังเคราะห์เอโฟโพรามิไดท์เคมี กับโซเดียมไอออนทางสรีรวิทยา) การทดสอบ endotoxin (ทำให้มั่นใจได้ว่า pyrogens อยู่ใต้เพดานที่ยอมรับได้) และการกรอง (ลดจำนวน CFU ที่ปนเปื้อนต่ำกว่าเพดานที่ยอมรับได้)   ผลิตภัณฑ์ Ou riScale Oligos ™เป็นวัสดุปริมาณมากสำหรับโครงการ vivo ที่สามารถสั่งซื้อได้ด้วยการทำให้บริสุทธิ์นี้และบริการเพิ่มเติมเหล่านี้ทั้งหมด

Delivery & Toxicity

แม้ว่าจะอยู่นอกเหนือขอบเขตของบทความนี้มีเอกสารทบทวนที่ยอดเยี่ยมหลายฉบับที่หารือเกี่ยวกับกลไกการจัดส่งต่างๆรวมถึงความเป็นพิษที่อาจเกิดขึ้น^{11,27,28,29,30}

สรุป

เมื่อคุณได้ออกแบบ ASO ที่คุณต้องการลองในการทดลองเราพร้อมที่จะสังเคราะห์ให้คุณ (ASO ของเรามีไว้สำหรับในหลอดทดลองและในรูโวสัตว์ [ ใช้งานวิจัยเท่านั้น]) หากต้องการความช่วยเหลือเพิ่มเติมโดยเฉพาะอย่างยิ่งเกี่ยวกับความเป็นไปได้ของการผลิต ASO ที่มีการปรับเปลี่ยนที่ไม่ได้มาตรฐานโปรดส่งคำขอไปที่ oligotechserv@sial.com

ข้อมูลอ้างอิง

1. Vickers TA. 2001. Fully modified 2' MOE oligonucleotides redirect polyadenylation. 29(6):1293-1299. https://doi.org/10.1093/nar/29.6.1293

2. Kole R, Krainer AR, Altman S. 2012. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11(2):125-140. https://doi.org/10.1038/nrd3625

3. Liang X, Sun H, Nichols JG, Crooke ST. 2017. RNase H1-Dependent Antisense Oligonucleotides Are Robustly Active in Directing RNA Cleavage in Both the Cytoplasm and the Nucleus. Molecular Therapy. 25(9):2075-2092. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.06.002

4. Baker BF, Lot SS, Condon TP, Cheng-Flournoy S, Lesnik EA, Sasmor HM, Bennett CF. 1997. 2?-O-(2-Methoxy)ethyl-modified Anti-intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Oligonucleotides Selectively Increase the ICAM-1 mRNA Level and Inhibit Formation of the ICAM-1 Translation Initiation Complex in Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Biol. Chem.. 272(18):11994-12000. https://doi.org/10.1074/jbc.272.18.11994

5. Deleavey G, Damha M. 2012. Designing Chemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing. Chemistry & Biology. 19(8):937-954. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2012.07.011

6. Patil SD, Rhodes DG, Burgess DJ. 2005. DNA-based therapeutics and DNA delivery systems: A comprehensive review. AAPS J. 7(1):E61-E77. https://doi.org/10.1208/aapsj070109

7. Goodchild J, Carroll E, Greenberg JR. 1988. Inhibition of rabbit ?-Globin synthesis by complementary oligonucleotides: Identification of mRNA sites sensitive to inhibition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 263(2):401-409. https://doi.org/10.1016/0003-9861(88)90652-2

8. Fisher TL, Terhorst T, Cao X, Wagner RW. 1993. Intracellular disposition and metabolism of fluorescently-labled unmodified and modified oligouncleotides microijjected into mammalian cells. Nucl Acids Res. 21(16):3857-3865. https://doi.org/10.1093/nar/21.16.3857

9. EDER PS, DeVINE RJ, DAGLE JM, WALDER JA. 1991. Substrate Specificity and Kinetics of Degradation of Antisense Oligonucleotides by a 3? Exonuclease in Plasma. Antisense Research and Development. 1(2):141-151. https://doi.org/10.1089/ard.1991.1.141

10. DAGLE JM, WEEKS DL, WALDER JA. 1991. Pathways of Degradation and Mechanism of Action of Antisense Oligonucleotides inXenopus laevisEmbryos. Antisense Research and Development. 1(1):11-20. https://doi.org/10.1089/ard.1991.1.11

11. Mansoor M, Melendez AJ. 2008. Advances in Antisense Oligonucleotide Development for Target Identification, Validation, and as Novel Therapeutics. Gene?Regul Syst Bio. 2GRSB.S418. https://doi.org/10.4137/grsb.s418

12. Khvorova A, Watts JK. 2017. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nat Biotechnol. 35(3):238-248. https://doi.org/10.1038/nbt.3765

13. Weiner GJ, Liu H, Wooldridge JE, Dahle CE, Krieg AM. 1997. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94(20):10833-10837. https://doi.org/10.1073/pnas.94.20.10833

14. KRIEG AM, MATSON S, FISHER E. 1996. Oligodeoxynucleotide Modifications Determine the Magnitude of B Cell Stimulation by CpG Motifs. Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 6(2):133-139. https://doi.org/10.1089/oli.1.1996.6.133

15. Henry S, Stecker K, Brooks D, Monteith D, Conklin B, Bennett C. 2000. Chemically modified oligonucleotides exhibit decreased immune stimulation in mice.. J Pharmacol Exp Ther. 292468-79. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10640282/

16. Williamson JR, Raghuraman M, Cech TR. 1989. Monovalent cation-induced structure of telomeric DNA: The G-quartet model. Cell. 59(5):871-880. https://doi.org/10.1016/0092-8674(89)90610-7

17. Tam R, Lin C, Lim C, Pai B, Stoisavljevic V. 1999. Inhibition of CD28 expression by oligonucleotide decoys to the regulatory element in exon 1 of the CD28 gene.. J Immunol. 1634292-9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10510368/

18. Murchie A, Lilley D. 1994. Tetraplex folding of telomere sequences and the inclusion of adenine bases.. The EMBO Journal. 13(4):993-1001. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1994.tb06344.x

19. Matveeva OV. 2000. Identification of sequence motifs in oligonucleotides whose presence is correlated with antisense activity. 28(15):2862-2865. https://doi.org/10.1093/nar/28.15.2862

20. Ho S. 1996. Potent antisense oligonucleotides to the human multidrug resistance-1 mRNA are rationally selected by mapping RNA-accessible sites with oligonucleotide libraries. 24(10):1901-1907. https://doi.org/10.1093/nar/24.10.1901

21. Wahlestedt C, Salmi P, Good L, Kela J, Johnsson T, Hokfelt T, Broberger C, Porreca F, Lai J, Ren K, et al. 2000. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97(10):5633-5638. https://doi.org/10.1073/pnas.97.10.5633

22. Mulamba GB, Hu A, Azad RF, Anderson KP, Coen DM. 1998. Human Cytomegalovirus Mutant with Sequence-Dependent Resistance to the Phosphorothioate Oligonucleotide Fomivirsen (ISIS 2922). Antimicrob. Agents Chemother.. 42(4):971-973. https://doi.org/10.1128/aac.42.4.971

23. Geary RS, Baker BF, Crooke ST. 2015. Clinical and Preclinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Mipomersen (Kynamro®): A Second-Generation Antisense Oligonucleotide Inhibitor of Apolipoprotein B. Clin Pharmacokinet. 54(2):133-146. https://doi.org/10.1007/s40262-014-0224-4

24. Liang X, Sun H, Nichols JG, Crooke ST. 2017. RNase H1-Dependent Antisense Oligonucleotides Are Robustly Active in Directing RNA Cleavage in Both the Cytoplasm and the Nucleus. Molecular Therapy. 25(9):2075-2092. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.06.002

25. Titze-de-Almeida R, David C, Titze-de-Almeida SS. 2017. The Race of 10 Synthetic RNAi-Based Drugs to the Pharmaceutical Market. Pharm Res. 34(7):1339-1363. https://doi.org/10.1007/s11095-017-2134-2

26. Gebert LFR, Rebhan MAE, Crivelli SEM, Denzler R, Stoffel M, Hall J. 2014. Miravirsen (SPC3649) can inhibit the biogenesis of miR-122. 42(1):609-621. https://doi.org/10.1093/nar/gkt852

27. Chan JH, Lim S, Wong WF. 2006. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(5-6):533-540. https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2006.04403.x

28. Godfrey C, Desviat LR, Smedsrød B, Piétri?Rouxel F, Denti MA, Disterer P, Lorain S, Nogales?Gadea G, Sardone V, Anwar R, et al. 2017. Delivery is key: lessons learnt from developing splice?switching antisense therapies. EMBO Mol Med. 9(5):545-557. https://doi.org/10.15252/emmm.201607199

29. Sun Y, Zhao Y, Zhao X, Lee RJ, Teng L, Zhou C. Enhancing the Therapeutic Delivery of Oligonucleotides by Chemical Modification and Nanoparticle Encapsulation. Molecules. 22(10):1724. https://doi.org/10.3390/molecules22101724

30. Krhac Levacic A, Morys S, Wagner E. 2017. Solid-phase supported design of carriers for therapeutic nucleic acid delivery. 37(5): https://doi.org/10.1042/bsr20160617