單細胞解析度發現
具有 10 倍基因組學相容性的池式 CRISPR 篩選
CRISPR 慢病毒產品是發現新基因和細胞通路的強大研究工具，對於了解人類健康和疾病至關重要。身為慢病毒文庫生產的全球領導廠商，我們可以根據任何規格來設計和建立客製化的文庫。有了這種能力，我們與 10x Genomics 合作，帶來創新的集合篩選產品，以單細胞解析度進行發現
CRISPR 為基礎的功能基因組學篩選提供了對可測量表型的基因貢獻的概觀。然而，大量篩選只能提供可選擇表型以外的有限功能資訊。在另一端，單細胞分析可提供候選基因全基因組轉錄組側面的高含量資訊。我們提供與 Chromium Next GEM 單細胞基因表達分析相容的最佳化慢病毒載體，並利用 10x Genomics 的特徵條碼技術。
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Recommendations
- 考慮使用我們的最佳化套件和/或個別克隆進行試驗研究
- 對於小池篩選，我們建議每個靶向導向基因使用 100-200 個細胞，
500-1000 個含有非靶向導向基因的細胞。 - 每個基因靶點使用 2-5 個 gRNA
具有 10 倍單細胞相容性的載體選項：
擷取序列整合
圖 1.CRISPRi 特徵條碼技術優化套件
本試劑盒包括代表 2 種可能的捕獲序列和 2 種位置組合（捕獲序列 1 或 2，在莖環或 3′ 位置）的病毒池。每個池中有 2 個 CRISPRi sgRNA，1 個是針對 RAB1A 的，1 個是非針對性的 control sgRNA。每個池子以 1x10^6 病毒滴度提供，足以覆蓋 MOI 為 0.5 的 ~2x10^6 cells。優化套件的目的是在訂購客製化池之前，建立試驗性篩選，以確定最佳的擷取序列和位置配置。
10x特徵條碼技術（gRNA）的相容產品
圖 2.我們建議建立自訂池，以便在執行 10x 單細胞 CRISPR 分析時，每個靶向導向因子可回收 100-200 個細胞，而含有非靶向導向因子的可回收 500-1000 個細胞。 舉例來說，如果使用者希望回收 10,000 個細胞作為目標，我們建議導向池中 10% 為非目標導向，其餘 90% 為目標導向。 對於此範例中的目標導引，我們建議每個目標導引佔整體導引池的〉=2%。 執行的細胞越多，非目標導航所佔的百分比就越小。
以單細胞解析度追蹤基因擾動
基因敲除效率：對數倍變化對比 p 值
圖 3.來自小型 CRISPRi 測試庫的結果，透過表達與正常水平的折疊變化，顯示每個導向因子對其目標基因的基因敲除效率。非靶向導向因子以及敲除效率較低的導向因子位於右下方象限，而那些表現出較強和統計上顯著抑制作用的導向因子位於左上方。由於細胞系的差異和 gRNA 的效率，每個基因使用多個 gRNA 進行靶向是很重要的，我們建議每個基因使用 3-5 個 gRNA。
單細胞分析與全片段輸出
圖 4.可透過 CRISPR 導向和轉錄物組剖面進行聚類的全新、更高解析度的分析。 A375 細胞以 10x Genomics 相容的載體中約 100 個導向因子進行轉導。每個點代表一個細胞 (A) 僅基於基因表達剖面的聚類。(B) 僅基於 CRISPR 導向因子特性的聚類。獨特的聚類表明該平台可以成功識別出獨特的導向因子，並以此為基礎探索由此產生的基因表達變化。(C)(A)中的特定細胞，代表存在非靶向導向或靶向 ELOF1 的 CRISPRi 導向。 (D)(C)中表達非靶向導向或靶向 ELOF1 導向的細胞中 ELOF1 的基因表達分析。表達資料顯示，在表達以 ELOF1 為靶點的 CRISPRi 導向因子的細胞中，ELOF1 mRNA 的存在顯著減少，作為概念驗證，顯示有可能在單細胞中同時分析轉錄組狀況和基因擾動。
其他資源
使用慢病毒進行單細胞 CRISPR 篩選的方案：
如需更多關於特徵條碼技術和分析的資訊：