Protocolo estándar de PCR
Cómo realizar una PCR
Una configuración estándar de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consta de cuatro pasos:
- Añadir los reactivos necesarios o la mezcla maestra y la molde a los tubos de PCR.
- Mezclar y centrifugar.
*Añadir aceite mineral para evitar la evaporación en un termociclador sin tapa calefactada. - Amplificar según los parámetros del termociclador y de los cebadores.
- Evaluar el ADN amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio.
A continuación se describen estos pasos con mayor detalle, junto con algunos consejos para la selección de materiales y reactivos. Se trata de un protocolo básico de PCR que utiliza la ADN polimerasa Taq.
Pasos de la PCR y componentes esenciales de la PCR
La resolución de problemas en una reacción de PCR implica muchos factores. Ve esta animación para descubrir cómo la selección de los componentes y las condiciones de ciclo adecuados a tus necesidades puede ayudarte a conseguir resultados óptimos.
Encontrarás protocolos adicionales para otras polimerasas o técnicas avanzadas de PCR en la sección «Protocolos» de nuestra Guía de tecnologías de PCR.
Obtenga más información sobre la PCR estándar, incluyendo qué es, en nuestra página «Conceptos básicos de la PCR».
Reactivos: ¿qué se necesita para la PCR?
¿Qué es la polimerasa Taq?
La ADN polimerasa Taq es una enzima termoestable derivada de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Se utiliza habitualmente para amplificar fragmentos de ADN en la PCR. La enzima se presenta en forma recombinante, expresada en E. coli. Es capaz de soportar calentamientos repetidos a 95 °C (tal y como exige la técnica de la PCR) sin una pérdida significativa de actividad. La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 94 kDa según el análisis por SDS-PAGE y no presenta actividad endonucleasa ni exonucleasa detectable. Posee actividad de ADN polimerasa en sentido 5'→3' y actividad de exonucleasa en sentido 5'→3'. Cada lote de ADN polimerasa Taq se somete a pruebas de amplificación por PCR y secuenciación de doble cadena. La enzima se suministra a una concentración de 5 unidades/µL y se presenta con un tampón de reacción 10x optimizado.
ADN polimerasa Taq estándar
Utilice la tabla siguiente para seleccionar una mezcla adecuada de ADN polimerasa Taq para sus condiciones de reacción. Elija entre formulaciones transparentes o teñidas de rojo, con o sin cloruro de magnesio (MgCl₂), o una mezcla lista para usar o una mezcla maestra con tampón y dNTP.
Definición de la unidad: Una unidad incorpora 10 nmol de desoxirribonucleósidos trifosfatos totales en ADN precipitable con ácido en 30 minutos a 74 °C.
Procedimiento: Pasos de la PCR
Las condiciones óptimas para la concentración de la Taq ADN polimerasa, el ADN molde, los cebadores y el MgCl₂ dependerán del sistema que se utilice. Puede ser necesario determinar las condiciones óptimas para cada componente individual. Esto es especialmente cierto en el caso de la Taq ADN polimerasa, los parámetros de ciclado y la concentración de MgCl₂. Se recomienda valuar la enzima y el MgCl₂ para determinar la eficiencia óptima.
- Añade los reactivos a un tubo del tamaño adecuado en el orden indicado en la tabla. (Selecciona la tabla adecuada para la preparación de la reacción: reactivos estándar o premezclados.) Para un gran número de reacciones, se debe preparar una mezcla maestra sin la molde y dividirla en alícuotas en los tubos de reacción. Al final, se debe añadir la molde a los tubos correspondientes.
Reacción de PCR estándar
*Compra el tampón y la polimerasa Taq juntos: D1806, D4309 o D4545
Reacción de PCR lista para usar
2. Mezcla suavemente con un vórtex y centrifuga brevemente para que todos los componentes se depositen en el fondo del tubo.
Nota: Añadir 50 µL de aceite mineral en la parte superior de cada tubo para evitar la evaporación si se utiliza un termociclador sin tapa calefactada.
3. Amplificar. Los parámetros de amplificación variarán en función de los cebadores y del termociclador utilizado. Puede ser necesario optimizar el sistema para cada cebador, molde y termociclador en particular.
Parámetros típicos de ciclado
Se recomiendan entre 25 y 30 ciclos de amplificación.
4. El ADN amplificado puede analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio.
Nota: La capa de aceite mineral puede eliminarse mediante una única extracción con cloroformo (1:1), recuperando así la fase acuosa.
Reactivos para la electroforesis de ácidos nucleicos
- Agarosa (geles prefabricados, polvo, etc.)
- Tampones como MOPS-EDTA-acetato de sodio, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
- Solución de carga del gel y tampón de carga de muestras para ARN
- Colorante para electroforesis, como el bromuro de etidio
Declaración de licencia de la etiqueta
AVISO AL COMPRADOR: EXENCIÓN DE RESPONSABILIDAD RELATIVA A LA LICENCIA
La compra de este producto no conlleva la concesión de ninguna licencia en virtud de ninguna de las patentes estadounidenses n.º 5.804.375, 5.994.056, 6.171.785, 6.214.979, 5.538.848, 5.723.591, 5.876.930, 6.030.787 y 6.258.569, ni de las patentes correspondientes fuera de Estados Unidos, ni de ninguna otra patente o solicitud de patente relacionada con los procesos de la nucleasa 5’ y del colorante de unión al ADN bicatenario. Para obtener más información, póngase en contacto con el director de licencias de Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE. UU.