qPCR
Bei der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) werden fluoreszierende Reportermoleküle verwendet, um die Quantifizierung der amplifizierten Produkte zu ermöglichen. Wie bei der herkömmlichen PCR wird eine DNA-, cDNA- oder RNA-Matrize amplifiziert, jedoch werden in jedem Zyklus Fluoreszenzsignale zur relativen oder absoluten Quantifizierung erfasst.
Diese Technik ist für zahlreiche Forschungsbereiche nützlich, darunter Genexpressionsanalyse, Genotypisierung, microRNA-Analyse, Analyse genetischer Variationen und Proteinanalyse.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist aus molekularbiologischen Labors nicht mehr wegzudenken. Die PCR dient der Vervielfältigung von DNA um mehrere Größenordnungen, und unsere Reagenzien und Ressourcen eignen sich für zahlreiche Forschungsabläufe, darunter Genexpressionsanalysen, Genotypisierung, Sequenzierung und Mutagenese.
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So analysieren Sie qPCR-Daten
Die Fluoreszenz der Reportermoleküle wird gemessen und quantifiziert; typischerweise handelt es sich dabei entweder um Farbstoffe (z. B. SYBR® Green, Ethidiumbromid), die sich zwischen die Basen der doppelsträngigen DNA einlagern, oder um Sonden, die so konzipiert sind, dass sie an eine bestimmte Sequenz (z. B. Molecular Beacons, TaqMan®-Sonden) auf der DNA binden.
Relative Quantifizierung von qPCR-Daten
Es gibt zwei wichtige Quantifizierungsmethoden für qPCR-Daten. Die relative Quantifizierung, die gängigere Methode, nutzt ΔΔCt-Informationen, anhand derer das Expressions- oder Abundanzverhältnis des Zielgens in der Probe im Vergleich zu einem Kontrollgen bestimmt und anhand des Expressionsverhältnisses eines Referenzgens normalisiert wird. Da sich die Effizienzwerte E für Ziel- und Referenzgene unterscheiden, berücksichtigt diese Methode auch die Unterschiede bei den E-Werten. Diese Methode wird häufiger in der Genexpressionsanalyse eingesetzt.
Absolute Quantifizierung von qPCR-Daten
Die zweite Methode, die absolute Quantifizierung, ist in der Umweltmikrobiologie gebräuchlicher und nutzt die Standardkurve (SC). Bei der SC-Methode werden Verdünnungsreihen mit bekannter Template-Konzentration N₀ verwendet, um mittels linearer Regression von log(N₀) gegen den CT-Wert (Threshold Cycle) eine Standardkurve zu erstellen. Diese wird dann zur Berechnung der Template-Konzentrationen der Probe herangezogen. Die Methode basiert auf der Annahme, dass der Effizienzwert der Probe dem des Standards entspricht.
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