Grundlagen der quantitativen PCR
Der quantitative PCR-Nachweis (formell quantitative Echtzeit-PCR, qPCR) baut auf der grundlegenden PCR-Technik auf und ermöglicht es Forschenden, die Menge des Ausgangsmaterials in einer Probe einzuschätzen. Da die Produkte im Verlauf der Reaktion nachgewiesen werden, hat die qPCR einen viel größeren dynamischen Analysebereich als die herkömmliche Endpunkt-PCR; einzelne Kopien und bis zu etwa 1011 Kopien können in einem einzigen Durchlauf nachgewiesen werden. Die quantitative Echtzeit-PCR und der anschließende Amplikonnachweis werden in einem geschlossenen Röhrchenformat durchgeführt, wodurch die Notwendigkeit einer Post-PCR-Manipulation, wie z. B. einer Gelelektrophorese, entfällt und das Risiko einer Kreuzkontamination deutlich verringert wird.
Die Grundprinzipien der qPCR werden auf dieser Seite erörtert und die Mechanismen der gängigen Nachweischemien werden unter Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweisverfahren beschrieben.
Grundprinzipien
Bei der qPCR wird ein fluoreszierender Reporterfarbstoff als indirektes Maß für die Menge der während jedes Amplifikationszyklus vorhandenen Nukleinsäure verwendet. Der Anstieg des Fluoreszenzsignals ist direkt proportional zur Menge der exponentiell ansteigenden PCR-Produktmoleküle (Amplikons), die während der sich wiederholenden Phasen der Reaktion produziert werden (siehe Polymerase-Kettenreaktion). Reportermoleküle werden in folgende Kategorien eingeteilt: doppelsträngige DNA (dsDNA) bindende Farbstoffe, an Primer konjugierte Farbstoffe oder zusätzliche farbstoffkonjugierte Oligonukleotide, die als Sonden bezeichnet werden (Quantitative PCR und digitale PCR-Nachweisverfahren).
Die Verwendung eines dsDNA-bindenden Farbstoffs, wie z. B. SYBR® Green I, stellt die einfachste Form der Nachweischemie dar. In freier Lösung oder wenn nur einzelsträngige DNA (ssDNA) vorhanden ist, emittiert der Farbstoff SYBR Green I Licht mit geringer Signalintensität. Je weiter die PCR fortschreitet und entsprechend die Menge an dsDNA größer ist, desto mehr Farbstoff bindet an die Amplikons und desto stärker wird das Signal.
Alternativ kann eine Sonde (oder eine Kombination aus zwei Sonden, abhängig von der Nachweischemie) einen Grad an Nachweisspezifität hinzufügen, der über den dsDNA-bindenden Farbstoff hinausgeht, da sie an eine spezifische Region des Templates bindet, die sich zwischen den Primern befindet. Das am häufigsten verwendete Sondenformat ist die doppelt markierte Sonde (Dual-Labeled Probe, DLP; auch als Hydrolyse- oder TaqMan® Sonde bezeichnet). Die DLP ist ein Oligonukleotid mit einer 5'-Fluoreszenzmarkierung, z. B. 6-FAM™, und einem 3'-Quenching-Molekül, wie einem der Dark-Quencher, z. B. BHQ®1 oder OQ™ (Quantitative PCR- und digitale PCR-Nachweismethoden). Diese Sonden sind so konzipiert, dass sie an das Template zwischen den beiden Primern hybridisieren und in Verbindung mit einer DNA-Polymerase verwendet werden, die eine inhärente 5‘→3‘-Exonukleaseaktivität aufweist. Wenn die DLP frei in Lösung ist, ist die Signalintensität gering, da sich der Reporterfarbstoff in unmittelbarer Nähe des Quencheranteils befindet. Je mehr Template während der Reaktion produziert wird, desto mehr Sonden hybridisieren mit dem Template, die wiederum durch die 5'→3'-Exonukleaseaktivität der fortschreitenden DNA-Polymerase gespalten werden. Die Intensität des Fluoreszenzsignals nimmt zu, wenn der 5'-Reporterfarbstoff in die Lösung abgegeben wird. Die Verwendung von Sonden, die mit verschiedenen Reporterfarbstoffen markiert sind, ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung mehrerer Ziele in einer einzelnen (Multiplex)-Reaktion.
Ein typischer qPCR-Lauf besteht aus wiederholten Zyklen mit abwechselnden Temperaturinkubationen, Zyklusverfahren 3.1. Dieses Profil wird häufig verwendet, wenn dsDNA-bindende Farbstoffe, Molecular Beacons oder Scorpions® Sonden als Nachweischemie für die qPCR gewählt werden. Die Primerverlängerung ist bei 72 °C am effizientesten, da dies die optimale Temperatur für die Prozessivität der meisten DNA-Polymerasen ist. Bei 72 °C erfolgt die Polymerisation mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Basen pro Sekunde. Die Prozessivität ist jedoch auch bei niedrigeren Temperaturen ausreichend, um kürzere Templates zu amplifizieren. Die qPCR-Amplikons sind in der Regel kürzer (< 200 Basen) als herkömmliche PCR-Produkte, sodass bei der Arbeit mit doppelt markierten Sonden (Zyklusverfahren 3.2) häufig die Verlängerung mit der Hybridisierung in einem Schritt bei 60 °C kombiniert wird.
Zyklusverfahren 3.1
Ein Beispiel für ein Standard-qPCR-Profil unter Verwendung von dsDNA-bindendem Farbstoff, Molecular Beacons oder Nachweis mit der Scorpions® Sonde.
- Initiale Denaturierung: Die Reaktionstemperatur wird auf 95 °C erhöht, und die Probe 2-10 min inkubiert (die Zeit hängt vom Hot-Start-Mechanismus des Polymeraseenzyms ab), um sicherzustellen, dass alle komplexen Ziele (dsDNA) separiert werden, einzelsträngig sind und für die Amplifikation zur Verfügung stehen.
- Zyklierung:
- Denaturierung: Die Reaktionstemperatur wird 10 s auf 95 °C erhöht, um die gesamte dsDNA zu schmelzen.
- Hybridisierung: Die Temperatur wird für 30 s auf 60 °C gesenkt, um die Bindung von Primer und Sonde (falls vorhanden) an das Template zu fördern.
- Polymerisation: Die anschließende Polymerisation erfolgt bei einer erhöhten Temperatur von 72 °C, die für die Prozessivität der TaqDNA-Polymerase optimal ist. Die Dauer der Polymerisation hängt von der Amplikongröße ab (30 s pro 1 kb). Die Dauer der Polymerisation hängt von der gewünschten Länge des Amplikons und dem verwendeten Enzym ab. Da qPCR-Amplikons kurz sind, beträgt diese Zeitspanne in der Regel 5-30 s.
- Denaturierung: Die Reaktionstemperatur wird 10 s auf 95 °C erhöht, um die gesamte dsDNA zu schmelzen.
- Wiederholung: Die Schritte 1-3 werden in der Regel in 40 Zyklen wiederholt.
Zyklusverfahren 3.2
Ein Beispiel für ein zweistufiges qPCR-Profil für den DLP-Nachweis.
- Initiale Denaturierung: Die Temperatur wird auf 95 °C erhöht und die Reaktion 2-10 min inkubiert (abhängig von den Heißstart-Eigenschaften des Polymerase-Enzyms).
- Zyklierung:
- Denaturierung: Die Reaktionstemperatur wird 10 s auf 95 °C erhöht, um die gesamte dsDNA zu schmelzen.
- Hybridisierung und Polymerisation: Die Temperatur wird für 30 s auf 60 °C gesenkt, um die Primerbindung an das Template zu fördern. Die anschließende Polymerisation erfolgt aufgrund der ausreichenden Aktivität der DNA-Polymerase bei dieser Temperatur.
- Wiederholung: Die Schritte 1-2 werden in der Regel in 40 Zyklen wiederholt.
Die Veränderung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion wird mit einem Echtzeit-PCR-Thermocycler gemessen. In dedizierten Echtzeit-PCR-Geräten wird die Temperaturzyklierung mit einer optischen Einheit kombiniert. Die optische Einheit liefert Licht einer geeigneten Wellenlänge, um das Fluorophor anzuregen, und weist die resultierende Emission nach. Viele moderne Geräte sind mit einem Bildschirm oder einem angebundenen Computermonitor ausgestattet, auf dem die Reaktion während ihres Verlaufs verfolgt werden kann (Abbildung 3.1).
Abbildung 3.1.Beispiel qPCR-Assay-Daten. A) Die verschiedenen Phasen der Reaktion. Basislinie: Die Anfangskonzentration des Templates ist niedrig; daher ist die Fluoreszenzintensität zu gering, um nachgewiesen zu werden, und nur das Hintergrundsignal ist evident. Exponential: Nachdem die Zielausbeute die Nachweisgrenze erreicht hat, die als rote Schwellenlinie dargestellt ist, kann der Verlauf der Reaktion durch die Exponentialphase verfolgt werden. Linear: Mit zunehmender Konzentration des Templates nimmt die verfügbare DNA-Polymerase-Konzentration ab und die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt. Plateau: Die Reaktion befindet sich im Bereich der maximalen Ausbeute. B) Einzelne Reaktionen werden durch den Zyklus charakterisiert, bei dem die Fluoreszenz erstmals über den Schwellenwert ansteigt. Dies wird als Quantifizierungszyklus (Cq) bezeichnet. Wenn das Ausgangsmaterial reichlich vorhanden ist, wird die Amplifikation in früheren Zyklen beobachtet und der Cq-Wert ist niedriger. Wenn das Ausgangsmaterial knapp ist, wird die Amplifikation in späteren Zyklen beobachtet und der Cq-Wert ist höher. Diese Korrelation zwischen Fluoreszenz, Cq und der Menge des amplifizierten Produkts ermöglicht die Quantifizierung des Templates über einen breiten dynamischen Bereich.
Quantifizierung und Analyse von gDNA-Zielen
Die quantitative Echtzeit-PCR kann ohne weiteres zur Analyse von gDNA-Zielen eingesetzt werden. Solche Studien können Genotypisierung/SNP-Bestimmung, Methylierungsanalyse, Screening transgener Sequenzen oder Überwachung von Insertionen und Deletionen sein.
Quantifizierung und Analyse von mRNA-Transkripten
Eine häufige Anwendung der qPCR ist die Genexpressionsanalyse, wie z. B. der Vergleich der mRNA-Konzentrationen eines Gens von Interesse zwischen Kontroll- und behandelten Proben. Die mRNA kann über ein zweistufiges oder einstufiges RT-qPCR-Verfahren quantifiziert werden (siehe Reverse Transkription Quantitative Echtzeit-PCR, um weitere Informationen zu RT-Reaktionen zu erhalten).
Zweistufige RT-qPCR
Reverse Transkription und qPCR-Reaktionen werden nacheinander in separaten Röhrchen durchgeführt. Als Ausgangsmaterial wird entweder Gesamt-RNA oder in selteneren Fällen Poly(A)+ RNA verwendet und cDNA wird durch Elongation von Oligo-dT-Primern, Random Primern, einer Mischung aus Oligo-dT-Primern/Random Primern oder genspezifischen Primern unter Verwendung eines Enzyms für reverse Transkriptase hergestellt. Ein Aliquot dieser Reaktion wird dann zur qPCR hinzugefügt.
Einstufige RT-qPCR
Wenn die reverse Transkription und die qPCR-Reaktionen in einem Röhrchen kombiniert werden, vereinfacht sich der Versuchsaufbau und die Gefahr einer Kontamination ist geringer, da die Probe nicht weiter bearbeitet werden muss.
Quantifizierung und Analyse von ncRNA-Transkripten
Die meisten nicht-codierenden RNA sind länger als 100 Nukleotide und können daher durch RT-qPCR mit den gleichen Techniken nachgewiesen und quantifiziert werden, die für die mRNA-Analyse verwendet werden. Im Gegensatz dazu haben kurze, nicht-codierende RNA, wie Micro- und Piwi-RNA, im Wesentlichen die Länge eines einzelnen PCR-Primers. Folglich ist eine Technik erforderlich, in der diese kurzen RNA vor der Durchführung der qPCR verlängert werden. In handelsüblichen Systemen werden vornehmlich zwei Ansätze verfolgt: 1) Verwendung eines Stamm-Schleifen-RT-Primers (Stemloop) und 2) Polyadenylierung, gefolgt von RT mit einem Oligo-dT-Adapterprimer (Abbildung 3.2). In einem von Casoldi et al. entwickelten alternativen Ansatz, der nicht im Handel erhältlich ist, wird die Ligation eines Adaptermoleküls an alle RNA in der Probe und ein spezifisches Primerdesign eingesetzt, um zwischen den gewünschten Zielen zu unterscheiden.1,2
Der Stammschleifen-RT-Primer-Ansatz wurde von Applied Biosystems (heute Life Technologies/Thermo) für die anschließende TaqMan-Sonden-basierte qPCR entwickelt und vermarktet.3 Wie in Abbildung 3.2A dargestellt, kann das 5'-Ende des RT-Primers eine Basenpaarung mit einer Region eingehen, die mehrere Nukleotide von seinem eigenen 3'-Ende entfernt ist, um einen basengepaarten Stamm zu bilden, der durch eine ungepaarte Schleife getrennt ist. Mit Ausnahme der letzten Nukleotide am 3'-Ende des RT-Primers sind alle universell, d. h. sie enthalten in allen miRNA-Primern die gleiche Sequenz. Die letzten Nukleotide am 3' Ende ausgehend vom Stamm sind komplementär zum 3'-Ende einer Ziel-miRNA. Durch die Verlängerung des Primers entlang eines miRNA-Templates entsteht eine cDNA, die mit einem miRNA-spezifischen Vorwärtsprimer und einem universellen Rückwärtsprimer amplifiziert werden kann, wobei letzterer komplementär zum 5'-Ende des Stammschleifen-RT-Primers ist.
In allen anderen kommerziellen miRNA qPCR-Methoden, einschließlich unserer Marke MystiCq®, wird Polyadenylierung eingesetzt, um die miRNA zu verlängern, wie von Shi und Chiang beschrieben.4 Poly(A)-Polymerase (PAP), ein Template-unabhängiges Enzym, katalysiert die Übertragung von Adenosinresten von ATP auf das 3'-Ende einer beliebigen RNA. Wie in Abbildung 3.2B dargestellt, kann die RT dann mit einem Oligo-dT-Primer durchgeführt werden. Der Oligo-dT-Primer enthält an seinem 5'-Ende eine Adaptersequenz, die eine anschließende qPCR mit einem Vorwärtsprimer, der komplementär zu einer spezifischen miRNA, und einem Rückwärtsprimer, der komplementär zu der Adaptersequenz ist, ermöglicht.
Abbildung 3.2.Es gibt zwei kommerziell erhältliche Methoden für RT und qPCR von miRNA. A) Ein Schleifenprimer wird verwendet, um den RT-Schritt nach der Hybridisierung an das 3'-Ende der miRNA zu starten. Die PCR-Verlängerung durch die Schleife führt zu einer Kombination aus miRNA und universeller Sequenz, die lang genug für die Amplifikation ist. B) Das Anhängen eines Poly-A-Schwanzes an die miRNA bietet eine Primeranlagerungsstelle für einen Primer, der aus einem Oligo-dT-Trakt und einer universellen Primer-Sequenz besteht. Nucleic acids research von Oxford University Press. Nachdruck mit Genehmigung der Oxford University Press bei Wiederverwendung in einem Buch/e-Buch über das Copyright Clearance Center.
Beide kommerzielle Ansätze haben Vor- und Nachteile. Stammschleifen-Priming ermöglicht eine zweistufige RT-qPCR, während die meisten Polyadenylierungsmethoden einen zusätzlichen RT-Schritt vor der qPCR erfordern. Es gibt Produkte, die Polyadenylierung und RT in einer einzigen Reaktion für eine zweistufige PAP-Tailing/RT-qPCR kombinieren. Der Nachweis kann jedoch bei diesem Ansatz weniger empfindlich sein (unveröffentlichte interne Ergebnisse). Umgekehrt entsteht bei der Polyadenylierung mit anschließender RT ein stabiler cDNA-Pool, mit dem jede mikroRNA, mRNA oder andere RNA sofort oder zu einem späteren Zeitpunkt nachgewiesen werden kann. Beim Stammschleifen-/TaqMan-Ansatz wird für den Nachweis jeder miRNA ein anderer Primer benötigt. Es können mehrere Stammschleifen-Primer zur gleichen RT-Reaktion hinzugefügt5 und RT-Primer-Pools für mehrere miRNA von Life Technologies erworben werden, um damit Multiplex-RT durchzuführen. Beide Optionen erlauben jedoch weder den qPCR-Nachweis von miRNA, die zu einem späteren Zeitpunkt entdeckt werden, noch erlauben sie den qPCR-Nachweis von mRNA aus derselben cDNA. Das von Castoldi et al.1,2 beschriebene System ist insofern einzigartig, als es den Nachweis von mRNA, Vorläufermolekülen und vollständig verarbeiteten miRNA-Molekülen aus derselben Gesamt-RNA-Probe ermöglicht.
qPCR-Anforderungen
Geräte
Viele qPCR-Geräte werden für einen bestimmten Anwendungsbereich entwickelt, wie z. B. das ABI 7900 für hohen Durchsatz mit automatischem Beladen von 384-Well-Platten im Vergleich zum Gerät Eco, das von Illumina hergestellt und vermarktet wird, und eine einzelne 48-Well-Platte unterstützt. Es ist genau das Gerät am besten geeignet, das den Anforderungen des jeweiligen Forschungsbereichs entspricht. Es ist von Vorteil, ein Gerät mit benutzerfreundlicher Software auszuwählen, das die meisten gewünschten Funktionen ausführen kann und flexibel in der Datenausgabe ist, sodass die Daten in Softwarepaketen, die im Downstream-Bereich eingesetzt werden, leicht für die statistische Analyse verändert werden können. Dies verkürzt die Zeit, die für die Schulung von Mitarbeitern und damit für das Erreichen von Ergebnissen erforderlich ist. Zu den weiteren erforderlichen Merkmalen gehören ein PCR-Block, der absolut einheitlich ist (eine absolute maximale Abweichung von 1 Cq = 2-fach über 96-Well-Replikation) und ein optisches System, das die Emission so empfindlich und gleichmäßig wie möglich über einen breiten Wellenlängenbereich anregt und nachweist. Dies erlaubt eine große Auswahl an Fluorophoren und ermöglicht Multiplexing. Weitere zu berücksichtigende Merkmale sind die Betriebskosten, die mit spezifischen Verbrauchsmaterialien einhergehen, z. B. wenn für die Reaktionen keine Standard-Mikrotiterplatte verwendet wird, und auch der Beladekomfort von Platten/Röhrchen, die nicht dem Standardformat entsprechen.
Template
Für das Auslösen der qPCR werden nur sehr wenige Kopien der Zielnukleinsäure benötigt (das entspricht etwa 100 pg gDNA oder cDNA). Zur Minimierung der Kontamination mit Reaktionsinhibitoren soll die Ausgangsmenge des Templates so gering gehalten werden, dass eine genaue Quantifizierung möglich ist. Handelt es sich beim Ausgangsmaterial um RNA, werden durch Primerdesign und DNase I-Behandlung Signale, die durch gDNA-Kontamination entstehen können, reduziert.
Primer
Unabhängig davon, ob ein dsDNA-bindender Farbstoff oder eine sondenbasierte Nachweischemie verwendet wird, ist die Entwicklung qualitativ hochwertiger Primer einer der wichtigsten Schritte vor der Durchführung von Versuchen in der qPCR. Eine detaillierte Behandlung der Assay-Planung finden Sie hier: Assay-Planung für PCR/qPCR/dPCR. Um die Empfindlichkeit und Spezifität zu maximieren, sollen alle erforderlichen Modifikationen, wie z. B. verbrückte Nukleinsäure, einbezogen werden (qPCR-Nachweischemie).
Sonde(n)
Bei der Verwendung von Sonden als Nachweismechanismus für Amplikons werden Primer-Dimere und unspezifische Produkte nicht nachgewiesen, sollen aber vermieden werden, da sie die Reaktionseffizienz verringern können. Um die Empfindlichkeit und Spezifität zu maximieren, soll der geeignete Sondentyp für die Anwendung ausgewählt und alle erforderlichen Modifikationen, wie z. B. verbrückte Nukleinsäuren, einbezogen werden (qPCR-Nachweischemie).
dNTP
Standard-PCR- und qPCR-Mastermischungen enthalten dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Es sind jedoch einige Mischungen erhältlich, in denen dTTP durch dUTP ersetzt werden. Produkte aus früheren Reaktionen, die mit dUTP durchgeführt wurden, enthalten Uracil anstelle von Thymin. Diese sind dann anfällig für die Spaltung durch Uracil-DNA-Glykosylase (UNG). Daher verhindert die vorherige Inkubation nachfolgender Reaktionen mit UNG eine Kontaminationsverschleppung zwischen den Reaktionen. Um effektiv zu sein, müssen in allen PCR im Labor dUTP eingesetzt werden.
Magnesium
Magnesiumchlorid (MgCl2) ist für die Aktivität der reversen Transkriptase, der Taq-DNA-Polymerase und der Taq-DNA-5‘→3‘-Exonuklease erforderlich. Die optimale Mg2+-Konzentration für Reaktionen, die DLP enthalten, liegt in der Regel zwischen 3 und 6 mM. Die meisten Mastermischungen enthalten MgCl2. Manchmal ist es jedoch notwendig, die Konzentration zu optimieren, weshalb dem Mastermix in der Regel ein zusätzliches Röhrchen mit reinem MgCl2 beigefügt wird (siehe Assay-Optimierung und -Validierung). In einigen Fällen kann eine Reaktionsmischung, die kein MgCl2 enthält, erforderlich sein, wie z. B. beim Nachweis mit der Scorpions® Sonde, damit eine niedrige Konzentration verwendet werden kann.
Reverse Transkriptase
Ein Reverse-Transkriptase-Enzym, das eine hohe Ausbeute an cDNA liefert und auch bei hohen Temperaturen aktiv bleibt, ist entscheidend für den Erfolg der RT-qPCR. Die Durchführung bei hohen Temperaturen trägt dazu bei, dass RNA-Regionen mit signifikanter Sekundärstruktur destabilisiert werden und für die Hybridisierung und anschließende Amplifikation zugänglich sind. Bei der einstufigen RT-qPCR ermöglicht die Hochtemperaturleistung die Verwendung genspezifischer Primer mit hoher Schmelztemperatur (Tm), wodurch die Reaktionsspezifität erhöht wird. Bei der Durchführung von zweistufigen Protokollen ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Enzym zu einer linearen und proportionalen Ausbeute von cDNA aus RNA führt (siehe Reverse Transkription, um Details zur Bewertung der RT zu erhalten).
Taq-DNA-Polymerase
Wie bei der Auswahl der am besten geeigneten reversen Transkriptase für die RT ist auch die Auswahl des geeigneten Polymerase-Enzyms entscheidend. Ein grundlegendes Problem der natürlichen Taq-DNA-Polymerase besteht darin, dass das Enzym bei niedrigen Temperaturen eine Restaktivität aufweist. Die unspezifische Primerbindung führt zu einer unspezifischen Produktbildung als Ergebnis dieser Rest-Polymeraseaktivität. Mit Antikörpern blockierte oder chemisch blockierte Taq-DNA-Polymerasen ("Hot-Start") tragen dazu bei, diese Situation zu korrigieren, indem sie die Enzymaktivität bis zum Beginn des Denaturierungsschritts bei hohen Temperaturen verhindern.
Puffer
Puffer oder Reaktions-Mastermischungen enthalten in der Regel dNTP, eine Taq-DNA-Polymerase, MgCl2 und Stabilisatoren. SYBR Green I-Farbstoff, ROX™, Fluorescein und inerte Ladefarbstoffe können abhängig von der Nachweischemie, vom Gerät und den Reaktionsanforderungen ebenfalls enthalten sein (Farbstoffe für die Ladekontrolle). Die Komponenten des PCR-Puffers und die Stabilisatoren sind in der Regel herstellerspezifisch. Bei separatem Kauf ist maximale Flexibilität möglich, da jeder Inhaltsstoff individuell in der Reaktion optimiert werden kann. Obwohl die gebündelte Beschaffung der Inhaltsstoffe als Mastermix die Flexibilität verringert, erhöht sie im Gegenzug die Chargenkonstanz und damit den Komfort durch die Reduzierung der Anzahl der Pipettierschritte und der Gefahr von Fehlern und Kontaminationen.
Farbstoffe für die Ladekontrolle
Einige Echtzeit-PCR-Thermocycler erfordern den Zusatz eines Ladefarbstoffs wie ROX zu jeder Reaktion, um Schwankungen im optischen System auszugleichen und Unterschiede in der Signalintensität zu normalisieren. Ebenso benötigen einige Thermocycler ein anfängliches Fluorescein-Signal, um einen virtuellen Hintergrund zu erzeugen, wenn mit SYBR Green I-Farbstoffassays gearbeitet wird (die einen sehr niedrigen Hintergrund haben). Diese können im Mastermix oder als separate Komponenten geliefert werden, sodass die entsprechende Konzentration verwendet werden kann.
Die MIQE-Leitlinien
Ein eindeutiges Problem bei der Verwendung von qPCR liegt darin dass es sehr einfach ist, Zahlen zu produzieren, die dann leicht als quantitative Ergebnisse interpretiert werden können. Dies kann jedoch ebenso irreführend sein, da eine Qualitätskontrolle und weitere Analysen erforderlich sein können, um zwischen potenziellen Artefakten zu unterscheiden, die durch eine ungeeignete Assayplanung, Durchführung oder Datenanalyse verursacht wurden. Die Veröffentlichung scheinbar aussagekräftiger Daten ohne angemessene Qualitätskontrollen hat zu Berichten geführt, die im besten Fall biologisch oder klinisch nicht relevant und im schlimmsten Fall ungenau sind.
Jeder Schritt im qPCR-Versuchsprozess, von der Probennahme bis zur qPCR-Datenanalyse, ist anfällig für Schwankungen.6 Daher kann es bei der Probenauswahl und -verarbeitung, der Nukleinsäureextraktion (kann zu Qualitätsunterschieden führen, die eine mangelnde Reproduzierbarkeit des qPCR-Zielnachweises zur Folge haben), der Assay-Planung und der Assay-Optimierung (tragen zu Unterschieden in der Assay-Effizienz und -Empfindlichkeit bei) und der Datenanalyse (erfordert eine gewisse subjektive Interpretation und die Anwendung geeigneter statistischer Methoden) zu Schwankungen kommen. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die Informationen, die einem wissenschaftlichen Publikum zur Verfügung gestellt werden, adäquate Informationen enthalten, damit der Versuch kritisch bewertet werden kann.7 Es ist jedoch offensichtlich, dass dies nicht immer der Fall ist.8 In den MIQE-Leitlinien9 "Mindestinformationen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-PCR-Experimenten" wird diesen Bedenken Rechnung getragen. Ziel der MIQE-Leitlinien ist es, die Transparenz zu erhöhen, indem die Mindestinformationen über einen Assay festgelegt werden, die der Leser benötigt, um die technische Validität einer Veröffentlichung zu beurteilen, und eine Anleitung für die Planung, Optimierung und Validierung neuer qPCR-Assays zu geben.
Die MIQE bestehen aus neun Abschnitten (Versuchsplanung, Probe, Nukleinsäuren, reverse Transkription, Ziel, Primer und Sonden, Assay-Details, PCR-Zyklen und Datenanalyse; besuchen Sie unsere MIQE-Seite, um eine Checkliste herunterzuladen, Tabelle 1). Alle Parameter beziehen sich auf Informationen, die im Prozess der Versuchsplanung, Optimierung und Validierung gewonnen werden sollen. Bei der Verwendung kommerzieller Assays oder solcher aus der veröffentlichten Literatur soll dennoch eine Optimierung und Validierung durchgeführt werden. Die MIQE-Publikation enthält eine Checkliste mit Faktoren, die als wesentlich (Essential) für eine adäquate Beschreibung des qPCR-Assays gelten, während andere Komponenten als erwünscht (Desirable) gekennzeichnet sind, was darauf hinweist, dass diese Informationen zwar nützlich sind, der Assay aber auch ohne sie repliziert und die Daten in der Veröffentlichung ausgewertet werden können. Es ist wichtig zu erkennen, dass die Angabe der PCR-Effizienz, der analytischen Sensitivität und der Spezifität jedes einzelnen Assays von grundlegender Bedeutung ist und vom Prüfer unter den im Labor vorherrschenden Bedingungen bestimmt werden soll. Bei der Durchführung der digitalen PCR (siehe Digitale PCR) gibt es besondere Überlegungen, die in einer kürzlich erschienenen MIQE-Publikation zur digitalen PCR behandelt wurden.10
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Mindestinformationen für die Veröffentlichung von quantitativen Echtzeit-PCR-Experimenten
aClinical chemical Copyright 2009 American Association For Clinical Chemistry, Inc. Reproduziert mit Genehmigung der American Association For Clinical Chemistry, Inc. im Format Internet-Posting über Copyright Clearance Center.
bAlle wesentlichen Informationen sind mit dem Manuskript einzureichen. Erwünschte Informationen sollen eingereicht werden, wenn sie verfügbar sind. Wenn die Primer aus der RTPrimerDB stammen, sind Informationen zu qPCR-Ziel, Oligonukleotiden, Protokollen und Validierung von dieser Quelle verfügbar.
cBei der ersten Extraktion von RNA ist es wichtig, die Abwesenheit von DNA mit einem No-Reverse-Transkriptionsassay zu überprüfen. Sobald die Probe als DNA-frei validiert wurde, ist die Einbeziehung einer nicht reversen Transkriptionskontrolle erwünscht, aber nicht mehr unbedingt erforderlich.
dDie Offenlegung der Sondensequenz ist sehr erwünscht und wird dringend empfohlen. Da jedoch nicht alle kommerziellen Anbieter vordefinierter Assays diese Informationen bereitstellen, kann es sich nicht um eine wesentliche Anforderung handeln. Von der Verwendung solcher Assays wird abgeraten.
Materialien
Literatur
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