Sequenzierung

Sanger-Sequenzierung

Schon früh war es mit Methoden der analytischen Chemie möglich, die Zusammensetzung von Nukleinsäuren zu bestimmen. Fred Sanger und seine Kollegen entwickelten jedoch Methoden – zunächst unter Verwendung radioaktiv markierter, verdauter Fragmente und zweidimensionaler Fraktionierung –, mit denen einige der ersten vollständigen Nukleinsäuresequenzen ermittelt werden konnten. Die Fortschritte auf diesem Gebiet setzten sich über mehrere Jahrzehnte fort, wobei jede Verbesserung zu einer wachsenden Bibliothek sequenzierter Proteine und Genome beitrug. Zu diesen Verbesserungen gehören die Trennung der Nukleotide nach Länge mittels Gelelektrophorese, gefolgt von Kapillarelektrophorese. Darüber hinaus prägen heute die Einbindung fluoreszenzmarkierter Nukleotide und die automatisierte Computeranalyse jedes Nukleinsäurefragments die moderne Sanger-Sequenzierungsmethode.

Methodik der DNA-Sequenzierung

Zwar haben sich die Methoden zur DNA-Sequenzierung seit den Anfängen dieser Technologie kontinuierlich verbessert, doch sind einige grundlegende Komponenten nach wie vor notwendig und werden von modernen DNA-Sequenzierungsplattformen genutzt. Die DNA-Aufbereitung umfasst in der Regel die Isolierung und Reinigung der DNA aus dem Wirtsorganismus. Weitere wichtige Komponenten, darunter freie DNA-Basen, DNA-Primer, modifizierte DNA-Basen mit Fluoreszenzmarkierungen (Terminatorbasen) und DNA-Polymerase, werden zusammen in ein einziges Gefäß gegeben. Das Gefäß, das all diese Komponenten enthält, erzeugt durch eine Reihe von Erwärmungs- und Abkühlungsschritten eine Bibliothek aus kleinen DNA-Sequenzen im Verhältnis zur vollständigen DNA-Sequenz von Interesse, die jeweils mit einer fluoreszenzmarkierten Terminatorbase am Ende abschließen. Die neuen DNA-Stränge, die die fluoreszenzmarkierten Nukleotide enthalten, werden nach ihrer Länge getrennt, durch ein Kapillarrohr geleitet und nach ihrer Größe geordnet. Anschließend wird die fluoreszierende Base an jedem Strang mit einem Laser angeregt, während eine Kamera das Signal erfasst. Zuletzt werden die gesammelten Informationen in der Regel mithilfe eines Computers zu der vollständigen DNA-Sequenz zusammengesetzt.