Verfahren zur Prüfung auf Pyrogene

Drei Arten von Pyrogenen sind in Blau, Cyan und Magenta vor einem gelben Hintergrund dargestellt.

Bei der Pyrogenprüfung wird die Menge an Pyrogenen in parenteralen pharmazeutischen oder biopharmazeutischen Produkten bestimmt; sie unterliegt verschiedenen Normen von Organisationen wie der Food and Drug Administration (FDA), der United States Pharmacopeia (USP) oder der Europäischen Pharmakopöe (EP). Die Sterilität eines Produkts bedeutet nicht, dass es frei von Pyrogenen ist. Daher müssen auch Arzneimittel, die als steril gelten, auf Pyrogene geprüft werden, um Fieberreaktionen bei Patienten zu verhindern.

Eine Pyrogenkontamination kann während der Herstellung oder der Verabreichung von Arzneimitteln, Biotherapeutika und Medizinprodukten auftreten, doch das Vorhandensein von Pyrogenen kann auch eine inhärente Eigenschaft des Produkts sein, wie beispielsweise bei Adjuvanzien in Impfstoffen oder synthetischen Lipopeptiden.

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Was ist ein Pyrogen?

Ein Pyrogen ist eine Substanz, die durch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems einen Temperaturanstieg (Fieberreaktion) bei Menschen oder Tieren hervorruft. Sie bilden eine heterogene Gruppe von Verunreinigungen, die aus mikrobiellen und nicht-mikrobiellen Substanzen besteht. Pyrogene lassen sich in zwei Gruppen einteilen: Endotoxine und Nicht-Endotoxin-Pyrogene (NEPs).

Endotoxine sind Substanzen, die in gramnegativen Bakterien vorkommen. Nicht-endotoxine Pyrogene sind andere mikrobielle Substanzen, darunter solche, die von grampositiven Bakterien oder Viren stammen, sowie Pyrogene aus Hefen und Pilzen. Nicht-mikrobielle pyrogene Substanzen können auch aus Gummipartikeln, mikroskopisch kleinen Kunststoffpartikeln oder Metallverbindungen in Elastomeren stammen.

Für den Nachweis von Pyrogenen stehen verschiedene Testmethoden zur Verfügung. Diese lassen sich anhand der Art der nachzuweisenden Verunreinigung und der Notwendigkeit der Verwendung tierischer Materialien zur Durchführung des Tests klassifizieren, wie in der folgenden Tabelle beschrieben:

Pyrogentest am
Kaninchen

Beim Kaninchen-Pyrogen-Test (RPT) wird der Temperaturanstieg bei Kaninchen nach intravenöser Injektion des zu prüfenden Produkts gemessen. Der RPT liefert qualitative Ergebnisse, und die Sensitivität ist relativ gering. Die Robustheit des Tests ist zudem begrenzt, da sich bei Kaninchen nach wiederholten Injektionen eine Pyrogentoleranz entwickeln kann oder die Tiere während der Durchführung des Tests unter Stress stehen.

Hinweis: Der Kaninchen-Pyrogen-Test (RPT) ist in Europa mittlerweile verboten; der Monozyten-Aktivierungstest (MAT) ist die Methode der Wahl zum Nachweis sowohl von Endotoxin- als auch von Nicht-Endotoxin-Pyrogenen.

Monozyten-Aktivierungstest

Der Monozyten-Aktivierungstest (MAT) ist eine Alternative zu tierbasierten Methoden zum Nachweis sowohl von Endotoxin- als auch von Nicht-Endotoxin-Pyrogenen. Der Monozyten-Aktivierungstest ahmt die menschliche Immunreaktion nach, indem Monozyten mit der zu untersuchenden Probe inkubiert werden. Sind Pyrogene vorhanden, werden die Monozyten aktiviert und produzieren Entzündungsmoleküle, sogenannte Zytokine, die für die Fieberreaktion verantwortlich sind. Die Zytokine werden anschließend mittels eines immunologischen Assays (ELISA) unter Verwendung spezifischer Antikörper und einer enzymatischen Farbreaktion nachgewiesen.

Hinweis: Seit Juli 2025 empfiehlt die Kommission der Europäischen Pharmakopöe (Ph. Eur.) die Verwendung des Monozyten-Aktivierungstests (MAT) als bevorzugte Methode für die Pyrogenprüfung. Der Kaninchen-Pyrogentest (RPT) ist in Europa nun verboten.

Lesen Sie den Artikel und tauschen Sie sich mit unseren Experten aus, um auf den MAT zur Erkennung von Endotoxin- und Nicht-Endotoxin-Pyrogenen umzustellen und dem regulatorischen Trend zu folgen.

Prüfung auf bakterielle Endotoxine (LAL-Test)

Die gängigste Methode zur Endotoxintestung ist der Limulus-Amoebozyten-Lysat-Test (LAL-Test), ein Assay, der auf dem Lysat von Amoebozyten aus dem Blut des Pfeilschwanzkrebses basiert. Das Lysat aus den Blutzellen des Pfeilschwanzkrebses reagiert auf natürliche Weise mit bakteriellen Endotoxinen in einer Gerinnungsreaktion. Diese Methode weist eine hohe Empfindlichkeit bei der Quantifizierung von Endotoxinen auf, erkennt jedoch keine Nicht-Endotoxin-Pyrogene.

Test mit rekombinantem Faktor C (rFC)

Der rekombinante Faktor C ist ein gentechnisch hergestelltes Protein, das normalerweise in der Limulus-Amöbozyten-Lysat-Kaskade vorkommt. Bei diesem Test reagiert Faktor C mit Endotoxinen und verbindet sich mit einem Marker, wodurch ein quantifizierbares, fluoreszierendes Endprodukt entsteht. Der Test mit rekombinantem Faktor C basiert auf dem gleichen Prinzip wie der LAL-Test, kommt jedoch ohne tierisches Material aus.

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