Métodos de teste de pirogênicos

Três tipos de pirogênios estão representados nas cores azul, ciano e magenta sobre um fundo amarelo.

O teste de pirogênios determina a quantidade de pirogênios em produtos farmacêuticos ou biofarmacêuticos parenterais e é regulamentado por diversas normas de organizações como a Food and Drug Administration (FDA), a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) ou a Farmacopeia Europeia (EP). A esterilidade de um produto não implica que ele esteja isento de pirogênios. Portanto, medicamentos que se pretendem ser estéreis também devem ser submetidos a testes de pirogênios para prevenir reações febris nos pacientes.

A contaminação por pirogênios pode ocorrer durante a produção ou a administração de produtos farmacêuticos, bioterapêuticos e dispositivos médicos, mas a presença de pirogênios também pode ser uma característica inerente ao produto, como adjuvantes em vacinas ou lipopeptídeos sintéticos.

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Caixa branca aberta com a etiqueta “PyroMAT Kit – Ensaio de Detecção de Pirógenos”, com pequenos frascos, viales e um conjunto de reagentes em placa de 96 poços dispostos ao redor dela.

Teste de pirógenos

Garantir a segurança: Testes de pirogênicos em produtos farmacêuticos por meio do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) para detectar pirogênicos endotóxicos e não endotóxicos.

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Uma cena sofisticada de um laboratório de testes de esterilidade, com destaque para um instrumento digital com tubulação. Ao redor, encontram-se vários frascos cheios de líquido em tons transparentes e âmbar, complementados por placas de Petri com meios de cultura azuis, vermelhos e transparentes. Uma gradinha com frascos de tampa vermelha sugere amostras preparadas ou meios de cultura.

Consumíveis, meios de cultura e instrumentos para testes de esterilidade

Instrumentos de laboratório e consumíveis para testes de esterilidade no controle de qualidade microbiológico: meios de teste de esterilidade, bombas, equipamentos e acessórios.

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Um cientista, usando EPI completo, observa uma amostra ao microscópio.

O que é um pirogênio?

Um pirogênio é uma substância que provoca um aumento da temperatura (reação febril) em seres humanos ou animais por meio da ativação do sistema imunológico inato. Eles constituem um grupo heterogêneo de contaminantes que inclui substâncias microbianas e não microbianas. Os pirogênios podem ser classificados em dois grupos: endotoxinas e pirogênios não endotóxicos (NEPs).

As endotoxinas são substâncias encontradas em bactérias Gram-negativas. Os pirogênios não endotóxicos são outras substâncias microbianas, incluindo aquelas derivadas de bactérias Gram-positivas, vírus, leveduras e fungos. As substâncias pirogênicas não microbianas também podem ter origem em partículas de borracha, partículas microscópicas de plástico ou compostos metálicos presentes em elastômeros.

Existem vários métodos de ensaio disponíveis para a detecção de pirogênios. Eles podem ser classificados com base no tipo de contaminante que detectam e na necessidade de materiais de origem animal para a realização do ensaio, conforme descrito na tabela abaixo:

Teste
de pirogênicos em coelhos

O teste de pirogênicos em coelhos (RPT) consiste na medição do aumento da temperatura corporal dos coelhos após a injeção intravenosa do produto em teste. O RPT fornece resultados qualitativos e sua sensibilidade é bastante baixa. A robustez do teste também é limitada, devido ao desenvolvimento de tolerância aos pirogênicos nos coelhos após injeções repetidas ou ao estresse sofrido pelos animais durante a realização do ensaio.

Observação: O teste de pirogênicos em coelhos (RPT) está agora proibido na Europa, e o Teste de Ativação de Monócitos (MAT) é o método de escolha para a detecção tanto de pirogênicos endotóxicos quanto não endotóxicos.

Teste de Ativação de Monócitos

O Teste de Ativação de Monócitos (MAT) é uma alternativa aos métodos baseados em animais para a detecção tanto de pirogênios endotóxicos quanto não endotóxicos. O teste de ativação de monócitos simula a reação imunológica humana por meio da incubação de monócitos com a amostra testada. Se houver pirogênios presentes, os monócitos são ativados e produzem moléculas inflamatórias, as citocinas, responsáveis pela reação febril. As citocinas são então detectadas por meio de um ensaio imunológico (ELISA) envolvendo anticorpos específicos e uma reação enzimática colorida.

Observação: A partir de julho de 2025, a Comissão da Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.) recomenda o uso do Teste de Ativação de Monócitos (MAT) como método preferencial para a análise de endotoxinas e pirogênios não endotóxicos. O Teste de Pirogênios em Coelhos (RPT) está agora proibido na Europa.

Leia o artigo e discuta mais a fundo com nossos especialistas para migrar para o MAT na detecção de endotoxinas e pirogênios não endotóxicos e acompanhar a tendência regulatória.

Teste de endotoxinas bacterianas (teste LAL)

O método mais comum para testes de endotoxinas é o teste do lisado de amebócitos de Limulus (teste LAL); um ensaio baseado no lisado de amebócitos do sangue do caranguejo-ferradura. O lisado das células sanguíneas do caranguejo-ferradura reage naturalmente com as endotoxinas bacterianas em uma reação de coagulação. Esse método possui alta sensibilidade para a quantificação de endotoxinas, mas não detecta pirogênios não endotóxicos.

Teste de BET recombinante (r-FC, r-CR)

O Fator C recombinante é uma proteína geneticamente modificada normalmente encontrada na cascata do lisado de amebócitos de Limulus. Neste teste, o Fator C reage com a endotoxina e se liga a um marcador para produzir um produto final fluorescente quantificável. O teste do Fator C recombinante utiliza o mesmo princípio do teste LAL, mas sem a necessidade de material de origem animal.

O Reagente de Cascata Recombinante (r-CR) é um reagente multicomponente geneticamente modificado que reconstitui a cascata de coagulação completa encontrada no lisado de amebócitos de Limulus. Nesse teste, as proteínas da cascata — o Fator C, o Fator B e a enzima pró-coagulante — reagem sequencialmente com a endotoxina para produzir um produto final quantificável. O teste r-CR reproduz toda a via do LAL, mas sem a necessidade de material de origem animal.

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