LC/MS/MS analýza steroidních hormonů v plazmě
Desky HybridSPE®-Fosfolipid zajišťovaly vynikající výtěžnost analytu těchto obtížných sloučenin ze vzorků plazmy s následnou LC/MS/MS analýzou na kolonách Ascentis® Express Fused-Core® C18. Extrakty neobsahovaly endogenní fosfolipidy, které mohou interferovat s kvantifikací, snižovat průchodnost vzorků a zkracovat životnost kolon.
Úvod
Z různých důvodů je stále častější trend převádět některé klinické metody z imunoanalýzy na LC/MS/MS. LC/MS/MS zlepšuje specifičnost testu, není omezena dostupností protilátek a umožňuje provádět multiplexní testy analytů současně. LC/MS/MS však není bez omezení, zejména interferencí z endogenní matrice vzorku, která může mít za následek mimo jiné zdánlivě náhodné a libovolné rozlišení v odezvě analytu1.
Cíle studie
Cíl této studie byl dvojí. Zaprvé vyvinout jednoduchou LC/ MS/MS metodu, včetně přípravy vzorků pomocí HybridSPEFosfolipidových destiček, pro přímou analýzu steroidních hormonů progesteronu, aldosteronu, kortikosteronu, deoxykortikosteronu, testosteronu a 17α-methyltestosteronu z krevní plazmy. Za druhé, porovnání pozadí z matrice vzorku mezi výslednou metodou přípravy vzorku a standardním srážením proteinů. vzorků.
Experimentální
Chromatografické (LC/MS/MS) podmínky
Chemické struktury steroidních hormonů jsou uvedeny na obrázku 1. Počáteční hodnocení bylo provedeno s použitím směsi steroidních hormonů pro stanovení chromatografických podmínek na koloně Ascentis Express C18. Profil gradientu byl rozšířen tak, aby bylo možné provést sledování matrice pro zpracovanou plazmu
.
Obrázek 1. Struktura steroidních hormonů
HybridSPE-Phospholipid Principy fungování
Technologie HybridSPE-Phospholipid kombinuje jednoduchou, standardizovanou metodiku srážení proteinů se specifičností extrakce na pevné fázi pro současné odstranění proteinů a fosfolipidů z biologických vzorků. Technologie je založena na hybridních částicích oxidu zirkoničitého a oxidu křemičitého pro cílenou izolaci fosfolipidů, zatímco materiály s PTFE fritami fungují jako hloubkový filtr pro účinné odstranění vysrážených proteinových částic. Zirkoniová část hybridní částice se chová jako Lewisova kyselina (akceptor elektronů), která silně interaguje s Lewisovými zásadami (donory elektronů), jako je fosfátová část fosfolipidů. Tato technologie umožňuje vysoce selektivní odstranění fosfolipidové matrice, přičemž zůstává neselektivní vůči široké škále analytů2.
Vývoj metody přípravy vzorků: Vývoj metody přípravy vzorků spočíval ve stanovení výtěžnosti standardních sloučenin z 96jamkových destiček HybridSPE-Phospholipid a následném převedení těchto podmínek pro použití s hrotovanými vzorky plazmy. Optimalizace metody spočívala ve vyhodnocení několika systémů srážecích rozpouštědel. Jakmile byla stanovena dostatečná výtěžnost analytů pro vzorky plazmy, závěrečná část studie spočívala v porovnání techniky HybridSPE-Phospholipid s běžně uznávanou proteinovou precipitací pro odstranění fosfolipidové matrice.
Výběr analytů ze standardního roztoku pomocí HybridSPE-Phospholipid
Vývoj metody s 96jamkovou destičkou HybridSPE-Phospholipid začal stanovením výtěžnosti šesti steroidů ze standardních roztoků. Byly vyvinuty kalibrační křivky externích standardů od 10 do 300 ng/ml každé sloučeniny v 1% (v/v) acetonitrilu kyseliny mravenčí:vodě (3:1). Do 96jamkové destičky HybridSPE-Phospholipid byl přidán 300 µl alikvotní podíl standardního roztoku (50 ng/ml). Vakuum bylo aplikováno po dobu 4 minut při 10" Hg. Vzorky byly poté přímo analyzovány.
Získání analytů z plazmy pomocí HybridSPE-Phospholipid
Primárním rozpouštědlem používaným u HybridSPE-Phospholipid pro precipitaci vzorků plazmy je 1% (v/v) kyselina mravenčí v acetonitrilu. Tento roztok použitý v poměru 3:1 se vzorkem plazmy účinně precipituje plazmatické bílkoviny. Kyselina mravenčí také narušuje vazbu cílových analytů s proteiny, čímž zajišťuje zvýšenou citlivost. U analytů s chelatačními vlastnostmi však použití 0,5 % (w/v) kyseliny citronové v acetonitrilu jako precipitační přísady a v předkondicionovacím kroku výrazně zvyšuje jejich výtěžnost z částic oxidu zirkoničitého a oxidu křemičitého.
Systém kyseliny mravenčí: 1% (v/v) kyselina mravenčí v acetonitrilu:voda (3:1)
Plazma potkanů stabilizovaná pomocí K2EDTA (Lampire Biological Laboratories, Pipersville PA) byla obohacena o analyty ze standardního roztoku. Na destičku HybridSPE-Phospholipid byl přidán alikvot 100 µl a následně 300 µl srážecího rozpouštědla s 1% kyselinou mravenčí a acetonitrilem. Destička byla 4 minuty míchána vortexem, umístěna na vakuový rozdělovač a vystavena vakuu 10" Hg po dobu 4 minut. Filtrát byl odebrán a analyzován přímo. Koncentrace steroidních hormonů v konečném vzorku byla ekvivalentní 50 ng/ml. Výtěžnost byla založena na interpolaci standardní křivky analytů v pufru.
Systém kyseliny citronové: 0,5% (w/v) kyselina citronová v acetonitrilu, pro chelataci sloučenin
Postup s kyselinou citronovou byl stejný jako postup s kyselinou mravenčí popsaný výše, s výjimkou těchto dvou kroků: Srážecím rozpouštědlem byla 0,5% (w/v) kyselina citronová v acetonitrilu. Destička HybridSPE-Phospholipid byla nejprve předkondicionována 300 µl/jamku 0,5% (w/v) kyseliny citronové v acetonitrilu.
Monitorování fosfolipidů z matrice vzorku plazmy
Spikované vzorky plazmy byly precipitovány pomocí 0,5% kyseliny citronové v acetonitrilu a analyzovány přímo. Monitorování fosfolipidů bylo provedeno pomocí Q3 plného skenování spolu se skenováním prekurzorových iontů 104 m/z. Gradientní chromatografické podmínky použité pro analýzu umožňují eluci fosfolipidů za podmínek vysokého obsahu organických látek.
Výsledky a diskuse
Gradientová eluce šesti steroidních hormonů na přístroji Ascentis Express C18 s detekcí LC/MS/MS je znázorněna na obrázku 2.
Obrázek 2. LC/MS/MS analýza steroidních hormonů
Podmínky
Kolona: Ascentis Express C18, 10 cm x 2,1 mm I.D., 2,7 µm (č. produktu 53823-U); mobilní fáze: (A) 5 mM mravenčan amonný, pH 4.0 s kyselinou mravenčí; (B) methanol; gradient: 60 % B po dobu 3 min, na 95 % B za 5 min, udržováno při 95 % B po dobu 2 min; průtoková rychlost: 0.3 ml/min; teplota kolony: 50 °C; tlak: 90 barů detektor: ESI(+), MRM; injekce: 2 µl; vzorek: 50 ng/ml každé sloučeniny; systém: Shimadzu LC-30AD, LCMS-8030
Výtěžnost analytu
Tabulka 1 .uvádí údaje o výtěžnosti steroidních sloučenin extrahovaných destičkami HybridSPE-Fosfolipid ze standardního roztoku pomocí systému s kyselinou mravenčí a ze spikované plazmy pomocí systémů s kyselinou mravenčí a kyselinou citronovou. Tabulka uvádí průměrnou zjištěnou koncentraci, směrodatnou odchylku a variační koeficient (% c.v.) opakovaných vzorků (n=8).
V systému s kyselinou mravenčí byla u standardních roztoků pozorována špatná výtěžnost a vysoká variabilita aldosteronu, kortikosteronu a deoxykortikosteronu. To je způsobeno chelatací kombinovaného místa karbonyl/karboxylová kyselina na těchto molekulách se zirkoniokřemičitým povrchem částic HybridSPE-fosfolipid. Struktury aldosteronu a progesteronu lze porovnat na obrázku 1. Všimněte si polohy karbonylové a hydroxylové skupiny, které dávají aldosteronu jeho chelatační tendenci. Předpokládalo se, že výtěžnost analytu z HybridSPE-fosfolipidu bude vyšší při extrakci ze séra nebo plazmy ve srovnání se standardními roztoky. Je to proto, že fosfolipidy jsou ve vzorku plazmy ve vysokém množství a silně interagují s molekulami zirkonia kyseliny Lewisovy na částicích HybridSPE-Phospholipid, čímž dochází k maskování těchto míst před citlivými analyty. Tabulka 1B tento předpoklad potvrzuje; výtěžnost a variabilita kortikosteronu a deoxykortikosteronu extrahovaných z plazmy se oproti extrakci vodných standardů výrazně zlepšila. Výtěžnost aldosteronu z plazmy však byla v systému s kyselinou mravenčí stále velmi špatná.
Nahrazením kyseliny mravenčí kyselinou citronovou je chelatační jev překonán. Kyselina citronová se chová jako chelatační činidlo, a pokud je využita jako přísada pro HybridSPE-fosfolipid, působí navázání na povrch zirkonia. Předkondicionování destiček kyselinou citronovou zabraňuje zadržení chelatačních sloučenin, ale nebrání selektivnímu zadržení fosfolipidů. Tabulka 1C ukazuje, že použití kyseliny citronové jako srážecí přísady spolu s krokem předkondicionování výrazně zvyšuje výtěžnost a reprodukovatelnost chelatačních sloučenin z částic HybridSPE-Fosfolipid.
Monitorování koextrahované fosfolipidové matrice
Na obrázku 3 jsou uvedeny chromatogramy monitorování matrice pro techniku HybridSPE-Fosfolipid a srážení proteinů. Vzorky plazmy zpracované technikou HybridSPE-Phospholipid neměly ve srovnání se standardní technikou srážení proteinů žádné detekovatelné matricové interference. Ačkoli fosfolipidová matrice ze standardní techniky srážení proteinů se přímo nesrážela s cílovými analyty, stále by to představovalo problém pro zanášení MS zdroje. Fosfolipidová matrice by vedla k chromatografickému přenosu do následných vzorků, což by mělo za následek náhodné interference a potenciální selhání kolony.
Obrázek 3. Sledování koextrahované fosfolipidové matrice
Podmínky
kolona: Ascentis Express C18, 10 cm x 2,1 mm I.D., 2,7 µm (č. výrobku 53823-U); mobilní fáze: (A) 5 mM mravenčan amonný, pH 4.0 s kyselinou mravenčí; (B) methanol; gradient: 60 % B po dobu 3 min, na 95 % B za 5 min, udržováno na 95 % B po dobu 2 min; průtoková rychlost: 0.3 ml/min; teplota kolony: 50 °C; tlak: 90 barů
detektor: ESI(+), MRM; vstřik: 2 µl; vzorek: 50 ng/ml každé sloučeniny; systém: Shimadzu LC-30AD, LCMS-8030
Shrnutí
Systém 0,5% kyseliny citronové a acetonitrilu na destičkách HybridSPE-Phospholipid poskytl vynikající výtěžnost analytu a vysokou účinnost odstranění fosfolipidů ze vzorků plazmy. Tato studie ukazuje, že existují jednoduché a účinné přístupy, které lze použít v případě obzvláště obtížných analytů. V prezentovaném příkladu byla původně špatná výtěžnost chelatačních steroidních sloučenin v systému s kyselinou mravenčí překonána použitím systému s kyselinou citronovou, který eliminoval chelatační interakce. Metoda poskytla vysokou výtěžnost a nízkou variabilitu všech testovaných steroidů jak ze standardních roztoků, tak ze vzorků plazmy s příměsí. Systém kyseliny citronové byl také velmi účinný při odstraňování endogenních fosfolipidů z matrice. Závěrem lze říci, že s mírnou modifikací obecného protokolu se ukázalo, že HybridSPE-Phospholipid je účinný při redukci matrice a zároveň poskytuje vynikající výtěžnost obtížných, chelatujících analytů. HybridSPE-Phospholipid je jednoduchá a účinná technika přípravy vzorků pro LC/MS pro snížení matricových efektů při LC/MS analýze biologických vzorků.