Modrobílý screening a protokoly pro výběr kolonií
Identifikace rekombinantních bakterií
Blue-white screening je rychlá a účinná technika identifikace rekombinantních bakterií. Spoléhá na aktivitu β-galaktosidázy, enzymu vyskytujícího se v E. coli, který štěpí laktózu na glukózu a galaktózu.
Narušení genu LacZ
Přítomnost laktózy v okolním prostředí spouští v E. coli operon lacZ. Aktivita operonu vede k produkci enzymu β-galaktoisdázy, který metabolizuje laktózu. Většina plazmidových vektorů nese krátký úsek genu lacZ, který obsahuje kódovací informaci pro prvních 146 aminokyselin β-galaktozidázy. Použité hostitelské E. coli kmeny jsou kompetentní buňky obsahující deleční mutaci lacZΔM15. Když jsou tyto buňky schopny přijmout plazmidový vektor, vzniká díky procesu α-komplementace funkční enzym β-galatosidáza.
Plazmidové vektory používané při klonování jsou manipulovány tak, aby tento proces α-komplementace sloužil jako marker rekombinace. V rámci sekvence lacZ v plazmidovém vektoru je přítomno vícenásobné klonovací místo (MCS). Tuto sekvenci lze proříznout restrikčními enzymy a vložit tak cizí DNA. Když je plazmidový vektor obsahující cizí DNA přijat hostitelskou E. coli, nedojde k α-komplementaci, a proto se nevytvoří funkční enzym β-galaktosidáza. Pokud není cizí DNA do vektoru vložena nebo pokud je vložena na jiném místě než MCS, gen lacZ v plazmidovém vektoru doplňuje deleční mutaci lacZ v hostitelské E. coli produkující funkční enzym.
Jak funguje screening modrobílé barvy?
Pro screening klonů obsahujících rekombinantní DNA se na agarovou plotnu přidává chromogenní substrát známý jako X-gal. Pokud se vytvoří β-galaktosidáza, X-gal se hydrolyzuje za vzniku 5-brom-4-chlorindoxylu, který spontánně dimerizuje za vzniku nerozpustného modrého pigmentu zvaného 5,5'-dibromo-4,4'-dichlorindigo. Kolonie vytvořené nerekombinovanými buňkami se proto jeví jako modré, zatímco rekombinované buňky se jeví jako bílé. Požadované rekombinantní kolonie lze snadno vybrat a kultivovat.
Isopropyl β-D-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) se používá spolu s X-galem pro modrobílý screening. IPTG je nemetabolizovatelný analog galaktózy, který indukuje expresi genu lacZ. Je třeba poznamenat, že IPTG není substrátem pro β-galaktosidázu, ale pouze induktorem. Pro účely vizuálního screeningu je zapotřebí chromogenní substrát, jako je X-gal.
Obrázek 1.Schematické znázornění typického plazmidového vektoru, který lze použít pro modrobílý screening.
Obrázek 2.Schematické znázornění typického postupu modrobílého screeningu.
Modrobílé stínící výrobky (materiály)
Protokoly pro modrobílý screening
Kompletní protokol modrobílého screeningu zahrnuje 3 důležité kroky:
- Ligace: ligace cizí DNA do MCS plazmidového vektoru
- Transformace: zavedení plazmidového vektoru s vloženou cizí DNA do kompetentního E. coli
- Screening: modrobílý screening k identifikaci rekombinantních bakteriálních kolonií
Ligace
Nabízíme následující expresní vektory připravené k použití, které lze použít pro stabilní i přechodné expresní systémy. Tyto FLAG-fúzní konstrukty mají počátky replikace pro množení v bakteriálních i savčích buňkách.
Potřebný materiál
Následující nastavení reakce pro ligaci
- Všechny výše uvedené složky přidejte do čisté reakční zkumavky.
- Inkubujte 30 minut při 25 °C (lze provést v termocykleru).
- Přečistěte DNA pomocí PCR clean-up kolony a eluujte přibližně 50 µl.
- Transformujte 0,1-10 ng ligačního produktu do chemických nebo elektrokompetentních buněk kompatibilních s vektorem.
Transformace
Vysoce kvalitní plazmid je pro transformační postup nezbytný. Následující soupravy izolují a purifikují vysoce kvalitní plazmid vhodný pro transformaci.
Podrobný protokol transformace pomocí chemických nebo elektrokompetentních buněk najdete zde.
Screening
Nabízíme řadu chromogenních substrátů, které pomáhají při screeningu rekombinantních bakterií. Některé produkty lze použít k rozetření na LB agarové plotny (screeningový protokol 1), zatímco jiné se zapracovávají do mikrobiálního média (screeningový protokol 2). Tyto produkty se používají spolu s IPTG, kdekoli je to nutné. Protokoly pro oba postupy jsou uvedeny níže.
Screeningový protokol 1 (platí pro čísla výrobků B6650, 16658, B2904, B3928, 16669, B8931)
- Na LB agarové plotny rozetřete 40 µl nebo odpovídající množství zásobního roztoku chromogenního substrátu a 10 µl roztoku IPTG pomocí sterilního rozmetadla (přidání IPTG při použití výrobku číslo B3928 není nutné, protože již obsahuje IPTG).
- Desky by měly obsahovat desky s příslušným antibiotikem a bez antibiotika jako kontroly.
- Desky nechte zaschnout v laminární komoře s mírně pootevřenými víčky.
- Rozetřete 10-100 µl transformované E. coli buněk na LB agarové desky pomocí sterilního rozmetadla.
- Inkubujte desky 24-48 hodin při 37 °C.
- Na povrchu agaru se objeví modré a bílé kolonie. Vyberte rekombinantní buňky v bílých koloniích ke kultivaci.
Screeningový protokol 2 (platí pro čísla výrobků S7313, S9811, C4478)
- Připravte LB agar navážením příslušného práškového média, agaru a vody do sterilní baňky. Případně odvažte příslušné množství C4478 a přidejte do vody ve sterilní baňce.
- Před autoklávováním přidejte do média 300 mg/l výrobků číslo S7313 a S9811 a 500 mg/l citrátu železito-amonného (číslo výrobku F5879). Tomuto kroku se vyhněte, pokud používáte C4478
- Autoklávujte médium a ochlaďte ho jen natolik, aby bylo možné s baňkou manipulovat.
- Přidejte do média vhodnou koncentraci vybraného antibiotika.
- Nalijte přibližně 25-30 ml LB agaru do sterilních destiček a nechte je s mírně pootevřenými víčky ztuhnout.
- Na destičky LB agaru rozetřete 10-100 µl transformovaných E. coli buněk pomocí sterilního rozmetadla.
- Inkubujte destičky 24-48 hodin při 37 °C.
- Na povrchu agaru se objeví modré a bílé kolonie. Vyberte rekombinantní buňky v bílých koloniích ke kultivaci.
Obrázek 3.Výběr modrobílé barvy rekombinantních bakterií pomocí X-gal.
Omezení modrobílého screeningu
- Modrobílá technika je pouze screeningový postup, nejedná se o selekční techniku.
- Gen lacZ ve vektoru může být někdy nefunkční a nemusí produkovat β-galaktosidázu. Výsledná kolonie nebude rekombinantní, ale bude se jevit jako bílá.
- Je možné, že do MCS bude vložena malá sekvence cizí DNA, která změní čtecí rámec genu lacZ. To má za následek falešně pozitivní bílé kolonie.
- Malé inserty uvnitř čtecího rámce genu lacZ mohou vést k nejednoznačným světle modrým koloniím, protože β-galaktosidáza je pouze částečně inaktivována.