RT-qPCR - Kvantitatív fordított transzkripciós PCR

Az RT-qPCR vagy kvantitatív reverz transzkripciós PCR a reverz transzkripció és a kvantitatív PCR vagy valós idejű PCR hatásait egyesíti a specifikus célpontok felerősítése és kimutatása érdekében. Az RT-qPCR számos alkalmazással rendelkezik, beleértve a génexpressziós szintek számszerűsítését, az RNS-interferencia (RNAi) validálását,  és a kórokozók, például vírusok kimutatását. A DNS-mennyiség mérésére használt fluoreszcens jel előállításának általános megközelítései ebben a technikában a következők: vagy hidrolízisszondák, például TaqMan^® szondák, vagy kettősszálú DNS-kötő festék, például SYBR^® zöld festék használata.

Mi az RT-qPCR?

A mennyiségi reverz transzkripciós PCR (RT-qPCR) az RNS kimutatását és mennyiségi meghatározását jelenti. A folyamatot a teljes RNS vagy mRNS reverz transzkripciója végzi a reverz transzkriptáz enzim segítségével komplementer DNS-é (cDNS), majd ezt követi e cDNS specifikus célpontjainak felerősítése és kimutatása az úgynevezett kvantitatív PCR (qPCR) vagy valós idejű PCR technikával. A PCR során minden egyes ciklusban a DNS mennyiségét valós időben mérik különböző fluoreszcens vegyszerek alkalmazásával. A fluoreszcens jel előállítására leggyakrabban vagy hidrolízisszondákat, például TaqMan^® szondákat, vagy kettősszálú DNS-kötő festéket, például SYBR^® zöld festéket használnak.

A fluoreszcens kémiai anyag kiválasztása olyan tényezőktől függ, mint az alkalmazás, a költségek, valamint az, hogy a vizsgálat singleplex vagy multiplex vizsgálatról van-e szó. A DNS-kötő festékeket előnyben részesítik az egykomplex, alacsony áteresztőképességű próbákhoz, mivel könnyebb megtervezni őket, kevesebb beállítási idővel járnak, és költséghatékonyabbak. A fluoreszcens szondákat gyakrabban alkalmazzák nagy áteresztőképességű, multiplex próbákban, amelyek nagyobb specificitást igényelnek.

A qPCR-rel kapcsolatos további információkért tekintse meg Kvantitatív PCR technikai útmutató

A RT-qPCR alkalmazásai

A RT-qPCR számos alkalmazási területe van. Az RT-qPCR technikát a következőkre használják:

• génexpressziós szintek számszerűsítésére
• RNSi validálására a szelektív gének funkcióvesztésének tanulmányozására
• kórokozók, például vírusok kimutatására a fertőző betegségek diagnosztizálására
• li>genetikailag módosított szervezetek (GMO-k)

Egylépéses RT-qPCR vs. kétlépéses RT-qPCR

Az RT-qPCR egylépéses vagy kétlépéses próbával végezhető. A megfelelő RT-qPCR módszer kiválasztásakor fontos figyelembe venni különböző tényezőket, mint például a költség, az alkalmazás és az assay típusa.

1. ábra. Az egylépéses RT-qPCR munkafolyamat és a kétlépéses RT-qPCR munkafolyamat összehasonlítása.

Egylépéses RT-qPCR

Az egylépéses RT-qPCR során a reverz transzkripció vagy cDNS-szintézis és a qPCR egyetlen csőben történik, szekvenciaspecifikus primerek alkalmazásával egy adott célpont amplifikálásához. Az egylépéses vizsgálatokban általában génmódosított reverz transzkriptázokat alkalmaznak, mivel ezek tolerálják a szekvencia-specifikus primerek lágyulásához szükséges magasabb hőmérsékletet. Az egylépéses vizsgálatot előnyben részesítik, ha ugyanazon gén ismételt mennyiségi meghatározását végzik, különösen a nagy áteresztőképességű és diagnosztikai alkalmazásokban. Egy másik szempont az egylépéses próbák kiválasztásakor az RNS minősége és ritkasága. Mivel a reakció során szintetizált cDNS nem menthető el külön aliquotként, az eredeti RNS-ből több mintára lehet szükség az assay megismétléséhez.

Kétlépéses RT-qPCR


A kétlépéses RT-qPCR során a reverz transzkripciót és a qPCR-reakciókat külön csövekben végzik, amelyekben külön pufferek és reagensek vannak. A kétlépéses vizsgálatokban véletlen hexamerek, oligo-dT primerek és/vagy génspecifikus primerek használhatók. A különálló pufferek és reagensek nagyobb rugalmasságot tesznek lehetővé a reverz transzkriptáz enzimek és a PCR-reagensek kiválasztásában, több lehetőséget biztosítva a nehéz sablonok amplifikációs hatékonyságának optimalizálására és javítására. Az első lépésben szintetizált stabilabb cDNS tovább koncentrálható és/vagy tisztítható, hogy későbbi felhasználás céljából elraktározható legyen, vagy felhasználható több gén mennyiségi meghatározására ugyanabból a mintából.

Tudjon meg többet a PCR-tesztek optimalizálásáról a Assay-optimalizálás és validálás oldal

One-Step RT-qPCR termékek nagy áteresztőképességű alkalmazásokhoz

Egylépéses RT-qPCR termékeink a reverz transzkriptáz és a forró indítású Taq-irányított antitest hatását kombinálják kényelmes ReadyMixTM PCR-reakciókeverékekben szonda alapú vagy SYBR^® Green alapú alkalmazásokhoz. Függetlenül a nehéz másodlagos szerkezetektől vagy a detektálási kémiától, ReadyMixTM PCR-reakciókeverékeinket kifejezetten úgy állítottuk össze, hogy kevesebb lépésben kiváló eredményeket érjünk el.

Termékeink könnyen illeszkednek a PCR-munkafolyamatba, és az egylépéses RT-qPCR-kísérletekhez megbízható termékek széles választékával - nem fog rosszul választani. Fedezze fel KiCqStart^® termékeinket és találja meg az Ön eszközéhez optimalizált ReadyMix™ master mixet, vagy fedezze fel JumpStart™ opciók az Ön kísérleti igényeihez optimalizálható kitekért. A nagy áteresztőképességű, gyors ciklusú, egylépéses RNS-kvantitatív meghatározáshoz szekvenciaspecifikus fluorogén szondák használatával válassza a KAPA PROBE FAST univerzális kitet. Válassza magabiztosan bármelyik RT-qPCR termékünket anélkül, hogy kompromisszumot kötne a minőség terén.

One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ KiCqStart^®KiCqStart^®. -  Kompatibilis az összes főbb qPCR eszközzel

A KiCqStartMinket.sup>^® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ reagensek szigorú hot-start mechanizmussal rendelkeznek a nagyobb specificitás érdekében, és úgy vannak kialakítva, hogy rendkívül toleránsak legyenek a mintákban lévő PCR-inhibitorokkal szemben. Ezeket a nagy érzékenységű, azonnal felhasználható mesterkeverékeket a kényelem érdekében tervezték, és a qPCR vagy RT-qPCR minden szükséges alapkomponensét tartalmazzák. Egyszerűen csak adja hozzá a primereket, a szondát és a vizet az assay koktél elkészítéséhez. Ez a termék ideális gyors vagy hagyományos qPC

Tudjon meg többet a műszerek kompatibilitásáról ezekkel a termékekkel a Teljes műszerkompatibilitási táblázat vagy fedezze fel Egyedi qPCR-próbaérzékelőinket.

JumpStart™ Taq ReadyMix™ - Optimalizálható az összes főbb qPCR eszközhöz

A JumpStart™. Taq ReadyMix™ termékeink RT-qPCR-hez egyesítik a Moloney Murine Leukémia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) és a JumpStart™ antitest-inaktivált Taq-polimerázunk előnyeit. A robusztus M-MLV RT képes átírni a nehéz másodlagos struktúrákon keresztül, még magas hőmérsékleten is, míg JumpStart™ Taq-polimerázunk nagyobb specificitást és érzékenységet biztosít, mint a standard Taq-polimeráz. Ezek a termékek kompatibilisek mind a cső- és tányéralapú, mind a kapilláris alapú eszközökkel.

Megtakarítás 20% az RT-qPCR ReadyMix™ (QR0200) árából, ha a pénztárnál az SGX kódot használja. Érvényes 2021. január 31-ig.

KAPA PROBE FAST - Kompatibilis minden fluorogén szondán alapuló technológiával

A KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix Universal Kit érzékeny és kényelmes megoldás az RNS-t mint templát használó valós idejű PCR-hez. A kitet nagy áteresztőképességű, gyors ciklusú, egylépéses RNS-kvantitatív meghatározásra tervezték szekvencia-specifikus fluorogén szondák használatával. Kompatibilis minden fluorogén szondán alapuló technológiával, beleértve a hibridizációs szondákat (pl. fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) szondák), hidrolízis szondákat (pl. TaqMan^® szondák) és kiszorító szondákat (pl., molekuláris jelzők).

Ez a készlet egy használatra kész koktél, amely a primerek, a szonda(k) és a templát kivételével minden komponenst tartalmaz a gyors ciklusú, szondaalapú valós idejű PCR-hez. A kit tartalmazza a KAPA PROBE FAST qPCR Master Mixet, ROX High és ROX Low referencia festékeket, KAPA RT Mixet és dUTP-t.

ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit - Kompatibilis az összes főbb qPCR eszközzel

A kitben található ABScript II reverz transzkriptáz megbízható reverz transzkripciót biztosít az RNS-nek. A reverz transzkripció után a Taq-polimeráz hot-start változata 95 °C-on aktiválódik, és ezzel egyidejűleg az ABScript II reverz transzkriptáz inaktiválódik. A szekvenciális PCR-reakcióban a Taq-polimeráz 5′-3′ exonukleáz aktivitása hasítja a hibridizált szondát, elválasztva a riportert a quencherről és fluoreszcens jelet szabadítva fel.

Az ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit egy használatra kész kit a reverz transzkripcióhoz és az azt követő szonda alapú qPCR-hez egyetlen csőben. A kit rugalmas formátuma két különálló 50X koncentrációjú ROX (passzív referencia) festéket tartalmaz, amelyet a specifikus qPCR eszközök igényei szerint kell hozzáadni.

Kizárólag kutatási célra. Nem használható diagnosztikai eljárásokban.

Kétlépéses RT-qPCR termékek a nagyobb rugalmasságért

A nagyobb rugalmasság érdekében a kísérletek nagyobb rugalmassága érdekében a reverz transzkripcióhoz, majd a szintetizált cDNS PCR-analíziséhez szükséges összes reagensünket külön csövekben kínáljuk. Magabiztosan építse be kétlépéses RT-qPCR-termékeinket a PCR-munkafolyamatba anélkül, hogy a rugalmasság terén kompromisszumot kellene kötnie. A megbízható PCR-termékeinkhez rendelkezésre álló különböző opciókkal nem fog rosszul választani."

cDNS-szintézis-készletek és -keverékek

A fordított transzkripciós igényeinek kielégítéséhez válasszon a különböző típusú enzimek és számos csomagolási lehetőség közül. Mindegyik termék tartalmazza az első szál szintézishez szükséges reagenseket, és elérhetőek különálló reagenseket tartalmazó készletként az optimalizáláshoz, vagy teljes keverékként a gyors és kényelmes első szál szintézishez.

RT enzimek - Reverse Transcriptases


Válasszon az RT enzimek gyűjteményéből, és találja meg az RNS-átirat összetettségének megfelelőt. Termékeink között megtalálhatóak a standard Avian Myeloblastosis Virus (AMV) és Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse Transcriptases, valamint ezek továbbfejlesztett változatai a nagyobb érzékenység érdekében.

Tudjon meg többet az RT-qPCR hibaelhárításról a RT-PCR / RT-qPCR hibaelhárítás oldalon.

qPCR-készletek

A ReadyMix^TM termékek a qPCR-hez szükséges összes komponenst tartalmazzák. Egyszerűen csak hozzá kell adni a fluoreszcens detektáló kémiát, a primereket és a templátot.

Szonda alapú qPCR

A szonda alapú qPCR a kívánt PCR-termék szekvenciaspecifikus detektálására támaszkodik. A SYBR^® Green alapú qPCR módszerekkel ellentétben, amelyek minden kettősszálú DNS-t detektálnak, a szonda alapú qPCR fluoreszcens jelölésű célspecifikus szondát használ, ami megnövelt specificitást és érzékenységet eredményez. Emellett számos fluoreszcens festék áll rendelkezésre, így többféle primer használható több szekvencia egyidejű amplifikálásához.

SYBR^® Zöld alapú qPCR

A SYBR^® Green I, egy általánosan használt fluoreszcens DNS-kötő festék, amely minden kettősszálú DNS-hez kötődik. A detektálás a fluoreszcencia növekedésének mérésével követhető nyomon a ciklus során. A SYBR^® Green I gerjesztési és emissziós maximuma 494 nm, illetve 521 nm. A SYBR^® Green alapú qPCR detektálásunk specificitását nagymértékben fokozza a forró indítású Taq polimeráz, mint például a JumpStart™ Taq beépítése.

Tudjon meg többet a SYBR^® Green alapú qPCR-ről a Ez a rövid videó.

MikroRNS-alapú RT-qPCR

MicroRNS-alapú RT-qPCR

A MystiCq^® termékcsaládunkban megtalálja a szükséges mikroRNS reverz transzkripciós termékeket.

MystiCq^® MikroRNS RT-qPCR SystemR

MystiCqMikroRNS RT-qPCR SystemR

MystiCq.sup>® mikroRNS-reagensek teljes SYBR® Green RT-qPCR munkafolyamatot biztosítanak az expresszió számszerűsítéséhez mindössze három lépésben:

1. Iszolálás
2. cDNS szintézis
3. Kvantitáció amplifikációval

Tudjon meg többet a MystiCq^® munkafolyamatról a MystiCq^® termékoldalunkon. Ezek a termékek rendelkeznek:

• Több mint 1400 előre megtervezett és nedves laboratóriumban tesztelt primerpár, amelyeket kizárólag érett mikroRNS-ek megcélzására terveztek
• Az összes mikroRNS átalakítása, így egyetlen mintából szinte korlátlan számú leolvasás érhető el
• Három különböző termékből választható a mikroRNS izolálásához
/li>

 

qPCR Assay Designs and Reagents for SARS-CoV-2 Research./h2>

Elkötelezettek vagyunk az iránt, hogy a kutatók számára megbízható forrásokat és eszközöket biztosítsunk a COVID-19 (SARS-CoV-2) elleni küzdelem támogatására. A közösség SARS-CoV-2-specifikus reagensek és protokollok iránti igényére válaszul tudósaink értékelték az RNS-alapú egylépéses RT-qPCR-készleteket a SARS-CoV-2 célpont kimutatására. For For Research Use Only. Nem diagnosztikai eljárásokban való felhasználásra.

Kísérleti felépítés és módszerek

Ezt a kísérletet annak megállapítására végeztük, hogy a One-Step RT-qPCR-kitjeink képesek-e a SARS-CoV-2 kimutatására. A vizsgálatot a SARS-CoV-2 kimutatására szolgáló CDC protokoll szerint végeztük, szintetizált SARS-Cov-2 RNS-t használtunk templátként, amelyet 10⁵, 10⁴, 10³, 10² és 10 kópiára hígítottunk. A vizsgálati minta tartalmazta a templátot, az egyes készletek reagenseit, a célpont-specifikus DNS-primereket /TaqMan^® szondakészleteket az N1 és N2 (N, nukleokapszid gén) számára. Minden egyes vizsgálatban NTC (no template control) minták is szerepeltek.

2. táblázat. A SARS-CoV-2 specifikus kimutatására tervezett primer- és szondakészletek (N1 és N2 vizsgálatok). Kizárólag kutatási célra. Nem diagnosztikai eljárásokban való felhasználásra.

Tesztelési eredmények

A: N1 Assay

B: N2 Assay

2. ábra. SARS-CoV-2 kimutatási próbák a Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (QR200 kat. sz.) használatával az N1 (A. ábra) és N2 (B. ábra) primer célpontok esetében.

A 2. ábrán látható SARS-CoV-2 kimutatási N1 (A. ábra) és N2 (B. ábra) vizsgálatokat a Quantitative RT-PCR ReadyMix™ (Cat. No. QR200) segítségével végeztük, szintetizált SARS-CoV-2 RNS-t használva templátként. Mindkét teszt érzékenységet mutatott a templát mindössze 10² -es kópiájának kimutatására. Az NTC minták esetében nem tapasztaltak amplifikációt

A: N1 Assay

B: N2 Assay

3. ábra. SARS-CoV-2 kimutatási próbák a KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (KCQS07 kat. sz.) felhasználásával az N1 (A ábra) és N2 (B ábra) primer célpontok esetében.

A 3. ábrán látható SARS-CoV-2 kimutatási N1 (A ábra) és N2 (B ábra) próbákat a KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ (Kat. No. KCQS07) szintetizált SARS-CoV-2 RNS-t használva templátként. Mindkét teszt érzékenységet mutatott a templáthoz képest már 10 kópia kimutatására. Az NTC minták esetében nem tapasztaltak amplifikációt.

A: N1 Assay

B: N2 Assay

4. ábra. SARS-CoV-2 kimutatási próbák a KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) Universal Kit (kat. sz. KK4752) felhasználásával az N1 (A grafikon) és N2 (B grafikon) primer célpontokra.

A 4. ábrán látható SARS-CoV-2 kimutatási N1 (A ábra) és N2 (B ábra) próbákat a KAPA PROBE FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) Universal Kit (Kat. No. KK4752) szintetizált SARS-CoV-2 RNS-t használva templátként. Mindkét teszt érzékenységet mutatott a templát akár 10² -es kópiájának kimutatására. Az NTC minták esetében nem tapasztaltak amplifikációt.

A: N1 Assay

B: N2 Assay

5. ábra. SARS-CoV-2 kimutatási próbák az ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (kat. sz. RK20407) használatával az N1 (A. ábra) és N2 (B. ábra) primer célpontok esetében.

Az 5. ábrán látható SARS-CoV-2 kimutatási N1 (A ábra) és N2 (B ábra) próbákat az ABScript II One Step RT-qPCR Probe Kit (kat. No. RK20407) szintetizált SARS-CoV-2 RNS-t használva templátként. Mindkét teszt érzékenységet mutatott a templáthoz képest már 10 kópia kimutatására. Az NTC-minták esetében nem tapasztaltunk amplifikációt.

Következtetés

A fenti eredmények azt mutatják, hogy az egylépéses RT-qPCR-reagensek és készletek ideálisak a SARS-CoV-2 célpontok kimutatására a SARS-CoV-2 kutatásban. Ezen információk alapján a One-Step RT-qPCR reagenseket használó próbák akár 100, vagy egyes esetekben akár 10 kópiát is képesek kimutatni az RNS-templátból.

Kizárólag kutatási célra. Nem diagnosztikai eljárásokban való felhasználásra.

Az ebben a műszaki cikkben bemutatott, nem publikált adatok belső kutatásból származnak.

A SARS-CoV-2 kimutatására szolgáló RT-qPCR termékekkel kapcsolatos további információkért látogasson el a Sigma-Aldrich.com/covid19

TRI Reagent^® for Total RNA Isolation

TRI Reagent^® ideális a teljes RNS gyors, gazdaságos és hatékony izolálására vagy az RNS, a DNS és a fehérjék egyidejű izolálására emberi, állati, növényi, élesztő, bakteriális és vírus eredetű mintákból.

Ez a termék, amely guanidin-tiocianát és fenol keveréke egyfázisú oldatban, hatékonyan oldja fel a DNS-t, az RNS-t és a fehérjét a szövetminta homogenizálásakor vagy lízisekor. Kloroform vagy 1-brom-3-klórpropan hozzáadása és centrifugálás után a keverék 3 fázisra válik szét: az RNS-t tartalmazó vizes fázisra, a DNS-t tartalmazó interfázisra és a fehérjéket tartalmazó szerves fázisra. A fázisok szétválasztása után az egyes komponensek izolálhatók. Egy ml TRI Reagens^® elegendő 50-100 mg szövetből, 5-10 ´ 106 sejtből vagy 10 cm² tenyészcsésze felületéből származó RNS, DNS és fehérje izolálásához monolayerben növesztett sejtek esetén.

Ez az egyik leghatékonyabb módszer a teljes RNS izolálására, és friss szövetből vagy sejtekből kiindulva mindössze 1 óra alatt elvégezhető. Az eljárás nagyon hatékony a 0,1-15 kb hosszúságú RNS-molekulák minden típusának izolálásához. A kapott RNS ép, kevés vagy egyáltalán nem tartalmaz szennyező DNS-t és fehérjét. Használható Northern blotokhoz, mRNS izoláláshoz,  in vitro transzlációhoz, RNáz-védelmi vizsgálathoz, klónozáshoz és PCR-hez.

A^® TRI Reagent^® -t számos kutatásban széles körben használták vírusok inaktiválására és vírus-RNS extrakciójára a SARS-CoV-2 kimutatására RT-qPCR próbák segítségével.^{1, 2, 3} Kimutatták, hogy ideális a mi-RNS izolálására és tárolására -80⁰C-on hosszabb ideig.⁴ A macska- és kutyakoronavírus RNS extrakciójára használták, amelyet a továbbiakban RT-PCR vizsgálatban használtak fel.^{5, 6} A SARS-CoV-vel fertőzött Vero sejtekből citoplazmatikus RNS izolálására is használták. ⁷

Kizárólag kutatási célra. Nem használható diagnosztikai eljárásokban.

Hivatkozások

1. Dimke H, Larsen SL, Skov MN, Larsen H, Hartmeyer GN, Moeller JB. Phenol-chloroform-based RNA purification for detection of SARS-CoV-2 by RT-qPCR: comparison with automated systems. https://doi.org/10.1101/2020.05.26.20099440

2. Alhamlan F, Alqahtani A, Bakheet D, Bohol M, Althawadi S, Mutabagani M, Almaghrabi R, Obeid D. Development and Validation of Two In-house, Low-Cost SARS-CoV-2 Detection Assays. https://doi.org/10.1101/2020.05.18.20105510

3. Toptan T, Hoehl S, Westhaus S, Bojkova D, Berger A, Rotter B, Hoffmeier K, Cinatl J, Ciesek S, Widera M. Optimized qRT-PCR Approach for the Detection of Intra- and Extra-Cellular SARS-CoV-2 RNAs. IJMS. 21(12):4396. https://doi.org/10.3390/ijms21124396

4. Mraz M, Malinova K, Mayer J, Pospisilova S. 2009. MicroRNA isolation and stability in stored RNA samples. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390(1):1-4. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.09.061

5. Gunn-Moore DA, Gruffydd-Jones TJ, Harbour DA. 1998. Detection of feline coronaviruses by culture and reverse transcriptase-polymerase chain reaction of blood samples from healthy cats and cats with clinical feline infectious peritonitis. Veterinary Microbiology. 62(3):193-205. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(98)00210-7

6. Erles K, Toomey C, Brooks HW, Brownlie J. 2003. Detection of a group 2 coronavirus in dogs with canine infectious respiratory disease. Virology. 310(2):216-223. https://doi.org/10.1016/s0042-6822(03)00160-0

7. Darnell ME, Subbarao K, Feinstone SM, Taylor DR. 2004. Inactivation of the coronavirus that induces severe acute respiratory syndrome, SARS-CoV. Journal of Virological Methods. 121(1):85-91. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2004.06.006

*Ez a cikk egy előnyomtatás, és nem került lektorálásra. Olyan új orvosi kutatásról számol be, amelyet még nem értékeltek ki, ezért nem használható a klinikai gyakorlat irányítására.