Clonazione ed espressione

Vettori di espressione proteica

I plasmidi, o vettori di espressione proteica, sono frammenti circolari di DNA che contengono numerosi elementi funzionali per la clonazione e l’espressione della proteina di interesse. La scelta del vettore di espressione appropriato è in parte determinata dal tipo di proteina, dall’organismo che la esprimerà, nonché dall’applicazione specifica e dalle questioni scientifiche che il ricercatore intende affrontare. L’ampia varietà di vettori di espressione disponibili consente ai ricercatori di scegliere quali elementi di clonazione, selezione dei cloni ed espressione proteica siano più adatti al proprio studio. Una volta selezionate la sequenza genica di interesse e il vettore di espressione, i ricercatori utilizzano comunemente nucleasi per tagliare con precisione il vettore in siti specifici, in modo da consentire alla sequenza genetica di interesse di essere clonata in fase di lettura e, infine, espressa in un organismo ospite. È importante sottolineare che i ricercatori utilizzano comunemente cellule chimicamente competenti e la trasformazione batterica per ospitare i plasmidi di DNA ricombinante, poiché questi sono stabili se conservati congelati a -70 °C.

Come trasfettare le cellule

La trasfezione cellulare si riferisce al processo di introduzione di DNA, RNA o proteine nelle cellule eucariotiche. I ricercatori hanno a disposizione una varietà di tecnologie fisiche, chimiche e biologiche per portare a termine questa fase del flusso di lavoro di espressione proteica. I metodi fisici, come l’elettroporazione, o quelli chimici, tra cui il fosfato di calcio (CaPi), la polietilenimmina (PEI) e i reagenti per lipofeczione, sono tutti comunemente utilizzati dai ricercatori. Gli scienziati hanno a disposizione anche sistemi di trasduzione virale, tra cui quelli lentivirali, oncoretrovirali e adenovirali. Tuttavia, l’uso di metodi di veicolazione virale richiede spesso misure aggiuntive di contenimento e monitoraggio per motivi di biosicurezza.

Sistemi di espressione proteica

I ricercatori utilizzano vari organismi per esprimere le proteine di loro interesse. I batteri sono comunemente utilizzati dai ricercatori poiché assorbono efficacemente i vettori di espressione, hanno tempi di raddoppio rapidi e possono produrre elevate quantità di proteine ricombinanti in condizioni ottimali. Tuttavia, essendo organismi procarioti, i batteri non sono in grado di fornire le modificazioni post-traduzionali richieste da alcune proteine. Le cellule eucariotiche, tra cui il lievito e le linee cellulari di mammiferi, facilitano le modificazioni post-traduzionali delle proteine e sono anch’esse comunemente utilizzate dai ricercatori. La scelta della linea cellulare più adatta all’espressione delle proteine ricombinanti e della strategia di espressione proteica dipende in larga misura dalle esigenze specifiche dell’applicazione e dalle questioni che lo scienziato intende affrontare.