Sequenziamento

Sequenziamento di Sanger

Fin dall’inizio, i metodi di chimica analitica erano in grado di determinare la composizione degli acidi nucleici. Tuttavia, Fred Sanger e i suoi colleghi svilupparono dei metodi – inizialmente utilizzando frammenti digeriti marcati radioattivamente e frazionamento bidimensionale – per ottenere alcune delle prime sequenze nucleiche complete. I progressi in questo campo sono proseguiti per diversi decenni, con ogni miglioramento che andava ad arricchire una libreria sempre più ampia di proteine e genomi sequenziati. Tra questi miglioramenti figurano la separazione dei nucleotidi in base alla lunghezza mediante elettroforesi su gel seguita da elettroforesi capillare. Inoltre, l’incorporazione di nucleotidi marcati con fluorescenza e l’analisi automatizzata tramite computer di ciascun frammento di acido nucleico definiscono oggi il moderno metodo di sequenziamento Sanger.

Metodologia di sequenziamento del DNA

Sebbene i metodi di sequenziamento del DNA abbiano continuato a migliorare sin dagli albori di questa tecnologia, diversi componenti fondamentali sono ancora necessari e vengono utilizzati dalle moderne piattaforme di sequenziamento del DNA. La preparazione del DNA comprende tipicamente l’isolamento e la purificazione del DNA dall’organismo ospite. Ulteriori componenti fondamentali, tra cui basi di DNA libere, primer di DNA, basi di DNA modificate contenenti marcatori fluorescenti (basi terminatrici) e DNA polimerasi, vengono aggiunti insieme in un unico recipiente. Il recipiente contenente tutti questi componenti, attraverso una serie di fasi di riscaldamento e raffreddamento, produrrà una libreria di piccole sequenze di DNA rispetto alla sequenza completa di DNA di interesse, ciascuna terminante con una base terminatrice marcata con fluorescenza all’estremità. I nuovi filamenti di DNA contenenti i nucleotidi marcati con fluorescenza all’estremità vengono separati in base alla lunghezza, fatti passare attraverso un tubo capillare e ordinati per dimensione. Viene quindi utilizzato un laser per eccitare la base fluorescente su ciascun filamento, mentre una telecamera cattura il segnale. Infine, in genere si ricorre a un computer per assemblare le informazioni raccolte nella sequenza completa di DNA.