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Test di sterilità

Il test di sterilità è un requisito fondamentale delle GMP per confermare che i prodotti farmaceutici, i dispositivi medici, i prodotti biologici e le terapie cellulari e geniche siano privi di microrganismi vitali prima della somministrazione ai pazienti. Un test di sterilità fallito — che si tratti di un risultato vero positivo o falso — comporta conseguenze significative: richiami di prodotti, rischi per la sicurezza dei pazienti e costose indagini normative.

Con l’evolversi degli standard della farmacopea e l’intensificarsi del controllo normativo, i moderni programmi di test di sterilità devono affrontare tre sfide interconnesse: accuratezza metodologica, integrità dei dati e rapidità di rilascio. Comprendere i metodi di test di sterilità disponibili, i relativi quadri normativi e gli ultimi progressi nei flussi di lavoro digitali e nei metodi microbiologici rapidi è essenziale per qualsiasi laboratorio di controllo qualità che operi secondo le GMP.

Dalla scelta del metodo di analisi più adatto al proprio prodotto e al formato di confezionamento, al soddisfacimento delle aspettative normative in continua evoluzione in materia di integrità dei dati e rapidità di rilascio, questa guida illustra ogni aspetto chiave dei test di sterilità.

Metodi di test di sterilità farmaceutici
Test di sterilità mediante filtrazione su membrana
Test di sterilità mediante inoculazione diretta
Metodi microbiologici rapidi (RMM) per i test di sterilità
Integrità dei dati e governance nei test di sterilità
Applicazioni dei test di sterilità: dai prodotti farmaceutici alle terapie cellulari e geniche
Flussi
di lavoro per i test di sterilità

Rivolgiti a un esperto

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Materiali di consumo, terreni di coltura e strumenti per i test di sterilità

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Metodi di analisi della sterilità dei prodotti farmaceutici

I test di sterilità previsti dalle farmacopee per i prodotti farmaceutici sono disciplinati dalle norme USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>, che richiedono che i campioni vengano coltivati in due terreni di coltura distinti per un periodo di incubazione di 14 giorni. Vengono utilizzati due terreni di coltura per garantire una copertura completa dei microrganismi: il terreno fluido tioglicolato (FTM) per i batteri anaerobici e aerobici (incubato a 32,5 °C) e il terreno di digestione di caseina e soia (SCDM), noto anche come brodo triptico di soia (TSB), per i batteri aerobici e i funghi (incubato a 22,5 °C). Qualsiasi torbidità osservata dopo l’incubazione indica una potenziale contaminazione microbica e deve essere indagata.

Sono riconosciuti due metodi da farmacopea: la filtrazione a membrana e l’inoculazione diretta. La scelta del metodo dipende dalla natura del prodotto, dal suo formato di confezionamento e dalle sue proprietà fisico-chimiche. Laddove la natura del prodotto lo consenta, la filtrazione su membrana è il metodo di scelta, come indicato dall’USP <71>, dalla Ph. Eur. 2.6.1 e dalla JP <4.06>, grazie alla sua sensibilità superiore e alla capacità di rimuovere le sostanze inibitorie. L’inoculazione diretta rimane applicabile nei casi in cui la filtrazione non sia fattibile.

Sebbene il periodo di incubazione di 14 giorni rimanga lo standard farmacopeico, i Metodi Microbiologici Rapidi (RMM) basati sulla tecnologia della bioluminescenza dell’ATP sono sempre più accettati dalle autorità regolatorie per i prodotti a breve durata di conservazione, comprese le terapie cellulari e geniche. Il nuovo capitolo USP <73> — «Metodi microbiologici basati sulla bioluminescenza dell’ATP per l’individuazione della contaminazione nei prodotti a breve durata di conservazione» — fornisce un chiaro quadro normativo per l’adozione degli RMM e per la convalida e l’implementazione di questa tecnologia, con entrata in vigore ad agosto 2025.

Indipendentemente dal metodo scelto, i requisiti di integrità dei dati si applicano in modo uguale a tutti i flussi di lavoro relativi ai test di sterilità: tutti i dati dei test devono essere completamente tracciabili, pronti per l’audit e conformi agli standard ALCOA++, al 21 CFR Parte 11 e all’Allegato 11 dell’UE — dal ricevimento del campione alla registrazione del risultato finale.

Test di sterilità mediante filtrazione a membrana

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Sterility Testing membrane filtration through a 0.45 µm membrane filter

Con oltre 50 anni di esperienza come pioniere del settore, la soluzione Steritest® garantisce test di sterilità affidabili e sicuri per risultati attendibili. La filtrazione a membrana è il metodo normativo di riferimento per i prodotti farmaceutici filtrabili secondo le norme USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>. Il campione viene fatto passare attraverso un filtro a membrana da 0,45 µm, dove i microrganismi vengono trattenuti e successivamente coltivati in terreni di coltura appropriati.

Questo metodo offre vantaggi fondamentali rispetto all’inoculazione diretta:

Maggiore sensibilità — l’intero campione, o un campione composito, viene filtrato attraverso un’unica membrana
Rimozione degli inibitori — i composti antimicrobici, quali antibiotici o conservanti, possono essere eliminati mediante risciacquo prima dell’incubazione, prevenendo risultati falsi negativi
Protezione del sistema chiuso — i moderni dispositivi di filtrazione a sistema chiuso garantiscono che il prodotto non sia mai esposto all’ambiente durante il test, riducendo significativamente il rischio di contaminazione esterna e di risultati di test non validi

L’uso di dispositivi di filtrazione a membrana monouso a sistema chiuso è considerato una best practice negli ambienti di test di sterilità conformi alle GMP, sia nelle cappe a flusso laminare che negli isolatori.

Prova di sterilità mediante inoculazione diretta

Nel test di sterilità mediante inoculazione diretta, un piccolo volume di campione viene trasferito in condizioni asettiche in un terreno di coltura adeguato e incubato. Sebbene semplice da eseguire, questo metodo presenta diverse limitazioni che i laboratori dovrebbero tenere in considerazione:

Sensibilità ridotta — è possibile inoculare solo piccoli volumi di campione, aumentando il rischio di non rilevare contaminazioni a basso livello
Interferenza dovuta alla torbidità — i prodotti intrinsecamente torbidi o colorati possono mascherare la crescita microbica durante l’esame visivo
Inibizione antimicrobica — i prodotti con proprietà antimicrobiche devono essere neutralizzati prima dell’inoculazione per evitare risultati falsi negativi

Automated microcolony counting for Rapid Sterility Testing

Metodi microbiologici rapidi (RMM) per i test di sterilità

Con l’evoluzione dei quadri normativi per adeguarsi all’innovazione, i metodi microbiologici rapidi (RMM) stanno acquisendo sempre maggiore accettazione come alternative scientificamente validate ai tradizionali test di sterilità previsti dalle farmacopee. Gli RMM sono particolarmente rilevanti per i prodotti con breve durata di conservazione — quali terapie cellulari e geniche, radiofarmaci e prodotti biologici a breve durata — per i quali un periodo di incubazione di 14 giorni è incompatibile con i tempi di rilascio del prodotto o con i programmi terapeutici dei pazienti.

Tra le tecnologie RMM più consolidate, la bioluminescenza ATP rileva la luce emessa dai microrganismi vitali in seguito alla reazione con un reagente bioluminescente, consentendo un rilevamento rapido, sensibile e quantitativo della contaminazione. A differenza dei metodi tradizionali basati sull’incubazione, la bioluminescenza ATP sostituisce la valutazione visiva soggettiva della torbidità con una misurazione quantitativa effettuata tramite strumenti, consentendo un’interpretazione dei risultati più tempestiva e più riproducibile.

L’introduzione della norma USP <73> — “Metodi microbiologici basati sulla bioluminescenza dell’ATP per il rilevamento della contaminazione nei prodotti a breve durata di conservazione”, in vigore dall’agosto 2025 — segna una significativa pietra miliare normativa, fornendo ai laboratori un chiaro quadro farmacopeico per l’implementazione e la convalida dei test di sterilità basati su RMM. A ciò si affianca la norma USP <1071>, che fornisce indicazioni più ampie sull’implementazione e la convalida dei metodi microbiologici rapidi.

Gli RMM sono adatti non solo per i test di sterilità del prodotto finale, ma anche per il monitoraggio della carica microbica in corso di produzione durante l’intero flusso di lavoro, offrendo ai laboratori una soluzione versatile e conforme per molteplici applicazioni di controllo della qualità.

Il Milliflex® Rapid System 2.0 è pienamente conforme ai requisiti della norma USP <73> e consente al vostro laboratorio di implementare un flusso di lavoro per i test di sterilità basato su RMM, convalidato e conforme, fornendo risultati in 5 giorni o meno.

Steritest Testing test record analysis using the M-Trace software

Integrità dei dati e governance nei test di sterilità

L'affidabilità di un risultato di un test di sterilità dipende dai dati su cui si basa — e le agenzie regolatorie di tutto il mondo stanno ponendo l'integrità dei dati al centro della conformità alle norme GMP in materia di microbiologia. Oltre alla metodologia, viene attribuita pari importanza alle modalità con cui i dati dei test di sterilità vengono generati, registrati e conservati durante l’intero ciclo di vita del test. Gli organismi di regolamentazione, tra cui la FDA, l’EMA e la PMDA, richiedono che tutti i dati di laboratorio soddisfino i principi ALCOA++: i dati devono essere Attribuibili, Leggibili, Contemporanei, Originali e Accurati, con ulteriori requisiti in termini di completezza, coerenza e disponibilità.

Negli Stati Uniti, il 21 CFR Parte 11 definisce i requisiti per le registrazioni elettroniche e le firme elettroniche, rendendo la documentazione digitale giuridicamente equivalente alle registrazioni cartacee. In Europa, l’Allegato 11 dell’UE stabilisce requisiti equivalenti per i sistemi informatizzati negli ambienti GMP. Nel loro insieme, queste normative definiscono un quadro chiaro per l’integrità dei dati relativi ai laboratori di controllo qualità, compresi i test di sterilità: l’acquisizione dei dati in tempo reale, la generazione automatica della traccia di audit e la completa tracciabilità digitale end-to-end — dall’identificazione dell’operatore e dai dati strumentali, alle informazioni sui campioni e ai risultati finali — sono sempre più richieste dalle autorità di regolamentazione durante le ispezioni GMP e considerate best practice del settore. Il software e l’app mobile M-Trace® aiutano il vostro laboratorio a soddisfare tali requisiti normativi.

Rivolgiti a un esperto

Applicazioni dei test di sterilità: dai prodotti farmaceutici alle terapie cellulari e geniche

I test di sterilità costituiscono un requisito di controllo qualità di routine in un’ampia gamma di settori regolamentati dalle norme GMP. Sebbene i principi fondamentali rimangano invariati, la scelta del metodo, il quadro normativo e i requisiti relativi alla rapidità dei risultati variano in modo significativo a seconda del segmento:

I prodotti farmaceutici — tra cui i prodotti iniettabili, i preparati oftalmici e i fluidi per infusione — rappresentano il volume maggiore di test di sterilità, disciplinati dalle norme USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>
Prodotti biologici, biosimilari e vaccini — prodotti parenterali sterili che richiedono rigorosi test di rilascio dei lotti secondo le GMP
Dispositivi medici — test di sterilità adattati alla tipologia del dispositivo, che utilizzano metodi di trasferimento diretto o di lavaggio del prodotto
Terapie cellulari e geniche (CGT) e ATMP — prodotti con durata di conservazione breve o ultrabreve, per i quali i metodi microbiologici rapidi sono spesso l’unica opzione praticabile per prendere decisioni di rilascio in giornata o il giorno successivo
Radiofarmaci — prodotti con emivita misurata in ore, per i quali la tradizionale incubazione di 14 giorni non è fattibile e i metodi microbiologici rapidi (RMM) sono sempre più obbligatori
Medicina tissutale e rigenerativa — conferma della sterilità prima del trapianto o della somministrazione"

Flussi di lavoro per i test di sterilità

Flusso di lavoro tradizionale previsto dalle farmacopee — filtrazione su membrana

Il seguente flusso di lavoro passo-passo descrive la prova di sterilità mediante filtrazione su membrana, come eseguita secondo USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>.

Preparazione del test — Assemblare il dispositivo di filtrazione a membrana e collegare il tubo alla pompa per il test di sterilità all’interno dell’ambiente controllato (cappa a flusso laminare o isolatore)

Risciacquo della membrana/prebagnatura del filtro — Prebagnare la membrana per ottimizzare l’efficienza di filtrazione e ridurre al minimo l’adsorbimento del prodotto sul filtro
Filtrazione del campione — Filtrare volumi uguali di prodotto in entrambi i contenitori; i microrganismi vengono trattenuti sulla membrana
da 0,45 µm
Risciacquo — Rimuovere i composti inibitori utilizzando una soluzione di risciacquo convalidata per prevenire risultati
falsi negativi
Riempimento dei terreni di coltura — Riempire i dispositivi di filtrazione a membrana con terreni
di coltura sterili SCDM (TSB) e FTM
Incubazione — 14 giorni a 32,5 °C (FTM) e 22,5 °C (SCDM). Queste temperature rappresentano i valori medi degli intervalli previsti dalla farmacopea, rispettivamente 30–35 °C e 20–25 °C, come specificato nelle norme USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>
Esame dei risultati — Controllo visivo della torbidità; qualsiasi torbidità deve essere indagata come potenziale contaminazione
microbica
Registrazione digitale dei test — L’acquisizione simultanea e automatica di tutte le fasi di prova, delle azioni dell’operatore e dei dati strumentali in un unico registro elettronico verificabile garantisce la conformità al 21 CFR Parte 11, ai principi di integrità dei dati ALCOA++ e alla prontezza alle ispezioni normative

Le descrizioni delle fasi sono allineate ai requisiti delle farmacopee USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 e JP <4.06>. La fase 8 riflette le attuali aspettative normative in materia di integrità dei dati ai sensi del 21 CFR Parte 11 e dell’Allegato 11 dell’UE, che vanno oltre i requisiti delle farmacopee.

Flusso di lavoro per test rapidi di sterilità — Bioluminescenza ATP

Per i prodotti con breve durata di conservazione — tra cui terapie cellulari e geniche, radiofarmaci e prodotti biologici a breve durata — il tradizionale periodo di incubazione di 14 giorni è spesso incompatibile con le tempistiche di rilascio del prodotto. I metodi microbiologici rapidi (RMM) offrono un’alternativa scientificamente convalidata e accettata dalle autorità di regolamentazione.

La bioluminescenza ATP è una delle tecnologie RMM più consolidate per i test di sterilità. Rileva la luce emessa dai microrganismi vitali a seguito della reazione con un reagente bioluminescente, consentendo un rilevamento rapido, sensibile e quantitativo della contaminazione. Il nuovo capitolo USP <73> — «Metodi microbiologici basati sulla bioluminescenza dell’ATP per la rilevazione della contaminazione nei prodotti a breve durata» — fornisce un chiaro quadro normativo per l’adozione degli RMM, con entrata in vigore ad agosto 2025.

Un tipico flusso di lavoro per i test rapidi di sterilità mediante bioluminescenza ATP si svolge come segue:

Filtrazione del campione — Il campione viene filtrato attraverso una membrana dedicata, che trattiene i microrganismi vitali
Applicazione del reagente ATP — I reagenti bioluminescenti vengono applicati sulla membrana, agendo sulle cellule vitali
Rilevamento e quantificazione automatizzati — Una telecamera di rilevamento altamente sensibile cattura e quantifica i segnali luminosi provenienti dai microrganismi vitali
Risultati in 5 giorni o meno — Fornisce risultati fino al 75% più rapidi rispetto al tradizionale metodo farmacopeico di 14 giorni. Il tempo effettivo per ottenere i risultati dipende dal metodo convalidato e dal tipo di prodotto.
Registro elettronico dei test — Tutti i risultati vengono registrati in un registro digitale conforme al 21 CFR Parte 11 e completamente verificabile

Questo flusso di lavoro si basa sulla tecnologia della bioluminescenza ATP come descritta nella norma USP <73>. La Fase 5 riflette gli attuali requisiti normativi in materia di integrità dei dati e tenuta dei registri elettronici ai sensi del 21 CFR Parte 11 e dell’Allegato 11 dell’UE.

I sistemi di monitoraggio della carica biologica (RMM) che utilizzano la bioluminescenza ATP sono adatti sia per i test di sterilità che per il monitoraggio della carica biologica in-process, fornendo ai laboratori una soluzione versatile, rapida e conforme lungo l’intero flusso di lavoro di produzione.