Protocollo standard per la PCR

Come eseguire la PCR

Una procedura standard di reazione a catena della polimerasi (PCR) si articola in quattro fasi:

1. Aggiungere i reagenti necessari o il mastermix e il templato nelle provette per PCR.
2. Miscelare e centrifugare.
   *Aggiungere olio minerale per impedire l'evaporazione in un termociclatore senza coperchio riscaldato.
3. Amplificare secondo i parametri del termociclatore e dei primer.
4. Valutare il DNA amplificato mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da colorazione con bromuro di etidio.

Di seguito vengono illustrate queste fasi in modo più dettagliato, insieme ad alcuni consigli sulla scelta dei materiali e dei reagenti. Si tratta di un protocollo PCR di base che utilizza la Taq DNA polimerasi.

Fasi della PCR e componenti essenziali della PCR

La risoluzione dei problemi relativi a una reazione PCR coinvolge numerosi fattori. Guarda questa animazione per scoprire come la scelta dei componenti e delle condizioni di ciclo più adatti alle tue esigenze possa aiutarti a ottenere risultati ottimali.

Per ulteriori protocolli relativi ad altre polimerasi o tecniche PCR avanzate, consulta la sezione “Protocolli” della nostra Guida alle tecnologie PCR.

Scopri di più sulla PCR standard, compreso cosa sia, nella nostra pagina Nozioni di base sulla PCR.

Reagenti: cosa serve per la PCR?

Che cos’è la Taq polimerasi?

La Taq DNA polimerasi è un enzima termostabile derivato dal batterio termofilo Thermus aquaticus. È comunemente utilizzata per amplificare frammenti di DNA nella PCR. L'enzima si presenta in forma ricombinante, espresso in E. coli. È in grado di resistere a ripetuti riscaldamenti a 95 °C (come richiesto dalla tecnica PCR) senza una significativa perdita di attività. L'enzima ha un peso molecolare di circa 94 kDa, determinato mediante SDS-PAGE, e non presenta attività endonucleasica o esonucleasica rilevabile. Presenta attività di DNA polimerasi 5'→3' e attività esonucleasica 5'→3'. Ogni lotto di Taq DNA polimerasi viene testato per l’amplificazione PCR e il sequenziamento a doppio filamento. L’enzima è fornito a 5 unità/µL ed è accompagnato da un tampone di reazione 10x ottimizzato.

Taq DNA polimerasi standard

Utilizzare la tabella sottostante per selezionare una miscela appropriata di Taq DNA polimerasi in base alle proprie condizioni di reazione. È possibile scegliere tra formulazioni trasparenti o colorate di rosso, con o senza cloruro di magnesio (MgCl₂), oppure un mix pronto all'uso o un master mix con tampone e dNTP.

Definizione dell'unità: un'unità incorpora 10 nmol di desossiribonucleosidi trifosfati totali nel DNA precipitabile con acido in 30 minuti a 74 °C.

Procedura: fasi della PCR

Le condizioni ottimali relative alla concentrazione della Taq DNA polimerasi, del DNA matrice, dei primer e del MgCl₂ dipenderanno dal sistema utilizzato. Potrebbe essere necessario determinare le condizioni ottimali per ogni singolo componente. Ciò vale in particolare per la Taq DNA polimerasi, i parametri di ciclo e la concentrazione di MgCl₂. Si raccomanda di effettuare una titolazione dell’enzima e del MgCl₂ per determinare l’efficienza ottimale.

1. Aggiungere i reagenti in una provetta di dimensioni adeguate nell’ordine indicato nella tabella. (Selezionare la tabella appropriata per la preparazione della reazione: reagenti standard o pre-miscelati.) Per un numero elevato di reazioni, è opportuno preparare un mastermix senza il DNA matrice e suddividerlo in aliquote nelle provette di reazione. Al termine, il DNA matrice deve essere aggiunto alle provette appropriate.
   

Reazione PCR standard

*Acquista il tampone e la Taq polimerasi insieme: D1806, D4309 o D4545

Reazione PCR pronta all’uso

2. Miscelare delicatamente con il vortex e centrifugare brevemente per far depositare tutti i componenti sul fondo della provetta.

Nota: aggiungere 50 µL di olio minerale nella parte superiore di ciascuna provetta per impedire l’evaporazione se si utilizza un termociclatore senza coperchio riscaldato.

3. Eseguire l’amplificazione. I parametri di amplificazione variano a seconda dei primer e del termociclatore utilizzato. Potrebbe essere necessario ottimizzare il sistema per i singoli primer, il modello e il termociclatore.

Parametri tipici di ciclizzazione

Si raccomandano 25-30 cicli di amplificazione.

4. Il DNA amplificato può essere analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio e successiva colorazione con bromuro di etidio.

      Nota: lo strato di olio minerale può essere rimosso mediante un’unica estrazione con cloroformio (1:1), recuperando la fase acquosa.

Reagenti per l’elettroforesi degli acidi nucleici

• Agarosio (gel prefabbricati, polvere, ecc.)
• Tamponi quali MOPS-EDTA-acetato di sodio, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Soluzione di caricamento del gel e tampone di caricamento del campione per l’RNA
• Colorante per elettroforesi, ad esempio bromuro di etidio

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