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Applicazioni della reazione a catena della polimerasi (PCR)

Fasi della RT-PCR dall'isolamento dell'RNA all'amplificazione - La PCR con trascrittasi inversa (RT) segue queste fasi: isolamento dell'RNA o dell'mRNA, annealing del primer, sintesi del primo filamento e amplificazione PCR.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una potente tecnica di biologia molecolare di base che rappresenta un metodo efficiente e rapido in vitro per l'amplificazione enzimatica di specifiche sequenze di DNA o RNA da varie fonti. Una PCR standard consiste in un DNA bersaglio, una serie di primer oligonucleotidici sintetici che affiancano la sequenza di DNA bersaglio, una DNA polimerasi termostabile (di solito la Taq polimerasi) e nucleotidi. Utilizzando i termociclatori, ogni ciclo di amplificazione prevede tre fasi: la denaturazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) in DNA a singolo filamento separato, l'annealing dei primer sulla sequenza di DNA bersaglio e l'estensione, in cui la DNA polimerasi estende il DNA dai primer, creando un nuovo dsDNA con un filamento vecchio e un filamento nuovo. I filamenti sintetizzati in un ciclo servono come modello nel successivo, con il risultato di aumentare di milioni di volte la quantità di DNA in soli 20 cicli.

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Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

La RT-PCR, o PCR a trascrittasi inversa, è una variante della tecnica PCR standard che prevede l'amplificazione di mRNA specifico ottenuto da campioni molto piccoli. Elimina la necessità del noioso processo di purificazione dell'mRNA richiesto dalle tecniche di clonazione convenzionali. Con la RT-PCR, oltre ai reagenti standard della PCR, si utilizzano la trascrittasi inversa e un campione di RNA. La miscela di reazione viene riscaldata a 37 ˚C, il che consente la produzione di copie di cDNA complementari dal campione di RNA da parte della trascrittasi inversa. Questo cDNA si annealizza quindi a uno dei primer, portando alla sintesi del primo filamento. Da qui segue la PCR standard che genera il dsDNA. La RT-PCR è spesso combinata con la PCR in tempo reale (qPCR), ampiamente utilizzata per la quantificazione dei livelli di trascrizione in cellule e tessuti.

Hot Start PCR

Hot Start PCR è una tecnologia che inibisce l'avvio a caldo della Taq polimerasi o l'incorporazione di dNTP modificati durante la preparazione della reazione fino a quando non si verifica una fase di attivazione termica. Sono disponibili vari metodi per arrestare l'attività della polimerasi ad avvio caldo, tra cui la modifica chimica, i metodi mediati da anticorpi e aptameri.

Endpoint PCR per l'amplificazione di target lunghi e accurati

Endpoint PCR è spesso utilizzata per rilevare la presenza di target e l'abbondanza relativa al termine della reazione. La lunghezza limitata delle sequenze prodotte durante la PCR standard, circa 5 kb, viene in parte superata con l'incorporazione di fattori aggiuntivi che forniscono attività di "correzione". La PCR lunga e accurata (LA) incorpora l'uso di una seconda polimerasi termostabile con esonucleasi 3′→5′ per riparare le scorrettezze nucleotidiche terminali, ottenendo una fedeltà significativamente maggiore e la capacità di amplificare bersagli di DNA fino a 40 kb di lunghezza.