標準的なPCRプロトコル

PCRの実施方法

標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の実験手順は、以下の4つのステップで構成されています：

1. PCRチューブに必要な試薬またはマスターミックスとテンプレートを加えます。
2. 混合し、遠心分離を行います。
   *加熱機能のないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発を防ぐために鉱物油を加えます。
3. サーモサイクラーおよびプライマーのパラメータに従って増幅を行います。
4. アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色を行って増幅されたDNAを評価する。

以下では、これらの手順について、使用する材料や試薬の選び方のヒントとともに、より詳しく説明します。これは、Taq DNAポリメラーゼを用いた基本的なPCRプロトコルです。

PCRの手順と必須のPCR構成要素

PCR反応のトラブルシューティングには、多くの要因が関わっています。このアニメーションをご覧いただき、用途に適した試薬やサイクル条件を選択することで、どのように最適な結果を得られるかをご確認ください。

その他のポリメラーゼや高度なPCR技術に関するプロトコルについては、当社の「PCRテクノロジーガイド」の「プロトコル」セクションをご覧ください。

標準的なPCRとは何かを含め、その詳細については、当社の「PCRの基礎」ページをご覧ください。

試薬：PCRには何が必要ですか？

Taqポリメラーゼとは何ですか？

Taq DNAポリメラーゼは、好熱性細菌Thermus aquaticusに由来する耐熱性酵素です。PCRにおいてDNA断片を増幅するために一般的に使用されています。この酵素は、大腸菌（E. coli）で発現された組換え型です。PCR技術で必要とされるように、95 °Cまでの加熱を繰り返し行っても、活性の著しい低下をきたすことなく耐えることができます。 この酵素の分子量はSDS-PAGE法により約94 kDaであり、検出可能なエンドヌクレアーゼ活性やエキソヌクレアーゼ活性は認められません。5'→3' DNAポリメラーゼ活性および5'→3' エキソヌクレアーゼ活性を有しています。 Taq DNAポリメラーゼの各ロットは、PCR増幅および二本鎖シーケンシングについて試験されています。本酵素は5単位/µLの濃度で供給され、最適化された10倍濃縮反応バッファーが付属しています。

標準Taq DNAポリメラーゼ

以下の表を参照し、反応条件に適したTaq DNAポリメラーゼの配合を選択してください。塩化マグネシウム（MgCl₂）の有無にかかわらず、無色または赤色着色された製剤、あるいはバッファーとdNTPを含む既調製のレディミックスまたはマスターミックスからお選びいただけます。

単位の定義：1単位は、74 °Cで30分間に、酸沈殿性DNAに合計10 nmolのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を組み込む量である。

手順：PCRの手順

Taq DNAポリメラーゼ、テンプレートDNA、プライマー、およびMgCl₂の濃度の最適条件は、使用するシステムによって異なります。個々の成分ごとに最適な条件を決定する必要がある場合があります。これは特に、Taq DNAポリメラーゼ、サイクリングパラメータ、およびMgCl₂濃度について当てはまります。最適な効率を決定するために、酵素とMgCl₂を滴定することを推奨します。

1. 表に示された順序に従って、適切なサイズのチューブに試薬を添加する。（反応セットアップには、標準試薬またはレディミックス試薬のいずれかの適切な表を選択すること。）反応数を多く行う場合は、テンプレートを含まないマスターミックスを調製し、反応チューブに分注する。最後に、適切なチューブにテンプレートを添加する。
   

標準PCR反応

*バッファーとTaqポリメラーゼをセットで購入：D1806、D4309、またはD4545

レディミックスPCR反応液

2. ボルテックスで穏やかに混合し、短時間遠心分離して、すべての成分をチューブの底に沈殿させます。

注：加熱機能のないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発を防ぐため、各チューブの上部に50 µLの鉱物油を添加してください。

3. 増幅を行う。増幅パラメータは、使用するプライマーおよびサーマルサイクラーによって異なる。個々のプライマー、テンプレート、およびサーマルサイクラーに合わせてシステムを最適化する必要がある場合がある。

代表的な増幅条件

25～30サイクルの増幅を推奨します。

4. 増幅されたDNAは、アガロースゲル電気泳動およびその後のエチジウムブロマイド染色によって評価することができる。

      注：鉱物油のオーバーレイ層は、クロロホルムによる単一の抽出（1:1）によって除去し、水相を回収することができる。

核酸電気泳動用試薬

• アガロース（プレキャストゲル、粉末など）
• MOPS-EDTA-酢酸ナトリウム、トリス-酢酸-EDTA（TAE）、またはトリス-ホウ酸-EDTA（TBE）などの緩衝液
• RNA用ゲルロード溶液およびサンプルロードバッファー
• エチジウムブロマイドなどの電気泳動用染色剤または色素

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

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