GST標識タンパク質精製におけるトラブルシューティングの戦略

本トラブルシューティングガイドでは、各種グルタチオンセファロース担体を用いた精製法の多くで生じる一般的な問題を取り上げます。

問題	考えられる原因	解決策
GST標識タンパク質が担体に結合しない／結合しにくい。	試料添加時の流速が速すぎる。	試料添加時の流速を下げるか、手動操作の場合は、添加後に試料と担体をしばらくインキュベートします。グルタチオンセファロースへのGST標識タンパク質の結合に影響を及ぼす重要パラメーターの1つは流速です。GSTとグルタチオンの結合速度は比較的遅いため、結合量を最大にするには、試料添加中の流速を低く保つことが重要です。
	物理的溶解（超音波処理など）によりGST標識タンパク質が変性した。過度の溶解は、標識タンパク質を変性させ、結合を妨げる可能性がある。	細胞溶解は、物理的／化学的に穏やかな条件で行ってください。溶解条件はこれまでの経験をもとに決めてください。
	GST標識タンパク質が試料中で凝集し、沈殿した。	細胞溶解前にDTTを試料に添加し、バッファーにもDTTを添加します。終濃度1～20 mM DTTを加えることで、GST標識タンパク質の収率が著しく上がる場合があります。
	標識タンパク質の濃度が低すぎる。	Amicon Ultra（アミコンウルトラ）を用いて試料を濃縮します。結合動力学は濃度依存的です。低発現タンパク質は高発現タンパク質ほど効率的に結合しない可能性があります。そのような場合は試料を濃縮することで改善が期待されます。
	発現させた目的タンパク質自体がGSTの構造を変化させ、その結合能を低下させた可能性がある。	元々のpGEXベクターから発現させたGSTで結合能をご確認ください。元々のpGEXプラスミドを有する細胞の溶解液を調製し、担体への結合を確認します。元々のプラスミドから産生されたGSTの結合能が高い場合、目的タンパク質自体がGSTの構造を変化させ、その結合能を低下させた可能性があります。担体との結合温度を4℃に下げ、洗浄を減らすことで十分な結合が得られる可能性があります。
	平衡化時間が短すぎる。	pH6.5～8.0のバッファー（例：PBS）を5カラム容量以上用いて、カラムを平衡化します。
	GST標識タンパク質の結合は、pHが6.5未満または8を超えると効率が悪くなる。	pH6.5～8.0のバッファー（PBSなど）で平衡化してから、清澄した細胞溶解液を添加します。 試料の溶解は必ずpH6.5～8.0で行ってください。試料が結合バッファーと同じ条件に調製されていることを確認します。
	GSTrapカラム：カラムの洗浄が必要です。	標準的なプロトコルに従ってカラムを洗浄します。GSTrapカラムを既に数回使用した場合は、新しいカラムに交換する必要があるかもしません。
	グルタチオンセファロース担体の使用回数が多すぎた。	未使用のグルタチオンセファロース担体をお使いください。
	GSTrapカラム：カラムまたはÄKTAシステムが詰まり、背圧が高くなり、結合しない。	カラムの詰まり：取扱説明書に従ってカラムを洗浄します。試料は必ず遠心分離および／または0.45 µmフィルターでろ過してから、カラムに添加してください。システムの詰まり：マニュアルに従いシステムを洗浄します。
GST標識タンパク質の溶出効率が良くない。	溶出バッファー量が不十分。	溶出バッファーを増量します。特にカラム内で標識タンパク質とGSTを切断した場合は、標識タンパク質の溶出により多くのバッファーが必要になる場合があります。
	溶出時間が不十分。	溶出時の流速を下げて溶出時間を長くします。GSTrapカラムの場合、試料添加時の流速は、1 mL HiTrapカラムで 0.2～1 mL／分、5 mL HiTrapカラムでは 0.5～5 mL／分に設定します。遠心機を用いる場合、溶出時の遠心速度を下げます。
	グルタチオン濃度が不十分。	溶出バッファーのグルタチオン濃度を上げます。多くの場合、推奨濃度10 mMで十分ですが、場合によって濃度を上げる必要があります。50 mM Tris-HCL 20～40mM還元型グルタチオン（pH8.0）を溶出バッファーとしてお試しください。
	溶出バッファーのpHが低すぎる。	溶出バッファーのpHを上げます：pHを8～9に上げると、溶出バッファーのグルタチオン濃度を上げなくても溶出が改善する可能性があります。
	溶出バッファーのイオン強度が低すぎる。	溶出バッファーのイオン強度を上げます。溶出バッファーに0.1～0.2 M NaClを加えても改善する可能性があります。
	溶出バッファー中のグルタチオンが酸化されている。	新たに調製した溶出バッファーを使うか、DTTを加えます。
	担体との非特異的な疎水性相互作用によりタンパク質が凝集し、標識タンパク質の可溶化と溶出が妨げられている。	非イオン性界面活性剤を溶出バッファーに加えます。0.1%トリトンX-100または2% n-オクチルグルコシドを添加すると、一部のGST標識タンパク質では溶出が大幅に改善されます。
溶出した目的タンパク質を電気泳動／ウェスタンブロッティングしたところ複数のバンドが見られた。	分子量70,000のタンパク質がGST標識タンパク質とともに精製される。	分子量70,000のタンパク質は、E. colidnaK遺伝子産物の可能性が高いです。このタンパク質はE. coliでタンパク質のフォールディングに関与しています。カラム添加前に標識タンパク質を50 mM Tris-HCl、2 mM ATP、10 mM MgSO4（pH7.4）中で37℃、10分間インキュベートすることにより、このような会合を阻止できると報告されています。 あるいは、標識タンパク質溶液をATP-アガロースなどの精製用担体に通すか、イオン交換クロマトグラフィーを行うことによりDnaKタンパク質を除去できます。
	標識タンパク質がプロテアーゼにより部分的に分解された可能性がある。	プロテアーゼ阻害剤を添加します。プロテアーゼによって標識タンパク質が部分的に分解されると、複数のバンドが生じることがあります。溶解液に1 mM PMSFを加えると、結果が改善する可能性があります。PMSFに代わる非毒性の水溶性化合物が4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（AEBSF）で、Roche BiochemicalsからPefabloc™ SCとして市販されています。 注記：セリンプロテアーゼインヒビターは、トロンビンまたは第Xa因子による切断処理前に除去しなければなりません。PreScissionプロテアーゼはコンセンサスなセリンプロテアーゼではなく、Cytiva™による試験では多くのプロテアーゼ阻害剤に感受性が認められていません。 PMSFには急性毒性があります。できるだけPefabloc™をご使用ください。
	宿主細菌内でタンパク質分解を受けた可能性がある。	プロテアーゼ欠損株を使用します：宿主細菌内でのタンパク質分解により、複数のバンドが生じる可能性があります。その場合は、宿主として E. coliの遺伝子欠損株を使用する必要があるかもしれません（例えば、lon欠損株またはompT欠損株）。E. coli BL21はOmpTプロテアーゼとLonプロテアーゼを産生できません。
	物理的溶解による細胞破砕が強すぎた可能性がある。	溶解時間を短縮する：細胞破砕は懸濁液がやや透明化してくることでわかります。顕微鏡観察で確認できます。物理的溶解の前にリゾチーム溶液（25 mM Tris-HCL［pH8.0］中に10 mg/mLリゾチーム）を試料の1/10量加えることで、結果が改善する可能性があります。 標識タンパク質を変性させる恐れがあるので、泡立てないようにします。過剰に溶解すると、GST標識タンパク質とともに宿主タンパク質の一部が精製されてくることがあります。
	シャペロンが共精製された可能性がある。	精製ステップを追加する：E. coliには新生タンパク質の正しいフォールディングに関与するシャペロンと呼ばれる各種タンパク質があります。これらが共精製されて、新たなバンドが生じる可能性があります。シャペロンには以下が含まれますが、これらに限りません：DnaK（分子量 約70,000)、DnaJ（分子量 約37,000)、GrpE（分子量 約40,000)、GroEL（分子量 約57,000)、GroES（分子量 約10,000)。これらの共精製されてくるタンパク質からGST標識タンパク質を精製する方法がいくつか報告されています。
	E.coliタンパク質と反応する抗体が、標識タンパク質試料中に存在する可能性がある。	抗体をE.coliタンパク質で吸着処理する：抗GST抗体は、その製造法により、E. coliタンパク質と反応する抗体を含んでいる可能性も考えられます。このような抗体はE. coli溶解液で吸着処理することにより、抗E. coli抗体を除去します。Cytiva™の抗GST抗体はE. coliタンパク質に対して吸着処理済みで、ウェスタンブロッティングにより非特異的バックグラウンド結合がないことを確認済みです。