วิธีการทดสอบสารก่อไข้

เอนโดท็อกซินเป็นสารที่พบในแบคทีเรียแกรมลบ ส่วนสารก่อไข้ที่ไม่ใช่เอนโดท็อกซินเป็นสารจากจุลินทรีย์อื่น ๆ ซึ่งรวมถึงสารที่มาจากแบคทีเรียแกรมบวก ไวรัส ยีสต์ และเชื้อรา สารก่อไข้ที่ไม่ใช่จุลินทรีย์อาจมีต้นกำเนิดจากอนุภาคยาง อนุภาคพลาสติกขนาดไมโครสโคปิก หรือสารประกอบโลหะในอีลาสโตเมอร์

มีวิธีการทดสอบหลายวิธีสำหรับการตรวจหาไพโรเจน ซึ่งสามารถจัดประเภทได้ตามประเภทของสารปนเปื้อนที่ตรวจพบ และความจำเป็นในการใช้วัสดุจากสัตว์เพื่อดำเนินการทดสอบ ดังที่อธิบายในตารางด้านล่าง:

การ
ทดสอบไพโรเจนในกระต่าย

การทดสอบไพโรเจนในกระต่าย (RPT) เกี่ยวข้องกับการวัดการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิในกระต่ายหลังจากการฉีดผลิตภัณฑ์ที่ทดสอบเข้าทางหลอดเลือดดำ RPT ให้ผลลัพธ์เชิงคุณภาพและความไวค่อนข้างต่ำ ความน่าเชื่อถือของการทดสอบนี้ยังมีข้อจำกัด เนื่องจากกระต่ายอาจพัฒนาความทนทานต่อไพโรเจนหลังจากการฉีดซ้ำหลายครั้ง หรือความเครียดที่กระต่ายได้รับขณะทำการทดสอบ

หมายเหตุ: การทดสอบไพโรเจนในกระต่าย (RPT) ปัจจุบันถูกห้ามใช้ในยุโรป และวิธีการทดสอบการกระตุ้นโมโนไซต์ (MAT) เป็นวิธีที่ได้รับการเลือกใช้สำหรับการตรวจหาทั้งไพโรเจนแบบเอนโดทอกซินและแบบไม่เอนโดทอกซิน

การทดสอบการกระตุ้นโมโนไซต์

การทดสอบการกระตุ้นโมโนไซต์ (MAT) เป็นวิธีการทางเลือกแทนวิธีการที่ใช้สัตว์ในการตรวจหาทั้งไพโรเจนแบบเอนโดทอกซินและแบบไม่เอนโดทอกซิน การทดสอบการกระตุ้นโมโนไซต์นี้จำลองปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของมนุษย์โดยการเพาะเลี้ยงโมโนไซต์ร่วมกับตัวอย่างที่ทดสอบ หากมีไพโรเจนอยู่ โมโนไซต์จะถูกกระตุ้นและผลิตโมเลกุลการอักเสบ (ไซโตไคน์) ซึ่งเป็นสาเหตุของปฏิกิริยาไข้ ไซโตไคน์เหล่านี้จะถูกตรวจหาโดยใช้การวิเคราะห์ทางภูมิคุ้มกัน (ELISA) ซึ่งเกี่ยวข้องกับแอนติบอดีเฉพาะและปฏิกิริยาเปลี่ยนสีด้วยเอนไซม์ 

หมายเหตุ: ตั้งแต่วันที่ 1 กรกฎาคม 2568 คณะกรรมการเภสัชตำรับยุโรป (Ph. Eur.) แนะนำให้ใช้การทดสอบการกระตุ้นโมโนไซต์ (MAT) เป็นวิธีที่แนะนำสำหรับการทดสอบเอ็นโดทอกซินและไพโรเจนที่ไม่ใช่เอ็นโดทอกซิน การทดสอบไพโรเจนในกระต่าย (RPT) ปัจจุบันถูกห้ามใช้ในยุโรปแล้ว

อ่านบทความและหารือเพิ่มเติมกับผู้เชี่ยวชาญของเราเพื่อเปลี่ยนไปใช้ MAT ในการตรวจหาเอ็นโดทอกซินและไพโรเจนที่ไม่ใช่เอ็นโดทอกซิน และเพื่อปฏิบัติตามแนวโน้มด้านกฎระเบียบ 

การทดสอบเอนโดทอกซินจากแบคทีเรีย (การทดสอบ LAL)

วิธีที่นิยมใช้มากที่สุดในการทดสอบเอนโดทอกซินคือ Limulus amoebocyte lysate test (LAL test) ซึ่งเป็นวิธีการทดสอบที่อาศัยสารสกัดจากเซลล์อะมีโบไซต์ในเลือดของปูเกือกม้า สารสกัดจากเซลล์เลือดของปูเกือกม้าจะเกิดปฏิกิริยาการแข็งตัวของเลือดกับเอนโดทอกซินจากแบคทีเรียโดยธรรมชาติ วิธีนี้มีความไวสูงในการวัดปริมาณเอนโดทอกซิน แต่ไม่สามารถตรวจหาไพโรเจนที่ไม่ใช่เอนโดทอกซินได้

การทดสอบ BET แบบรีคอมบิแนนท์ (r-FC, r-CR)

ปัจจัย C ที่สร้างขึ้นใหม่ (recombinant Factor C) เป็นโปรตีนที่สร้างขึ้นด้วยวิศวกรรมพันธุกรรม ซึ่งปกติพบในกระบวนการตกเลือดของเซลล์อะมีโบไซต์ของ Limulus ในการทดสอบนี้ ปัจจัย C จะทำปฏิกิริยากับเอนโดท็อกซินและจับคู่กับตัวบ่งชี้เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่มีฟลูออเรสเซนต์และสามารถวัดปริมาณได้ การทดสอบปัจจัย C ที่สร้างขึ้นใหม่ใช้หลักการเดียวกันกับการทดสอบ LAL แต่ไม่จำเป็นต้องใช้วัสดุที่มาจากสัตว์ 

สารรีเอเจนต์คาสเคดแบบรีคอมบิแนนท์ (r-CR) เป็นสารรีเอเจนต์หลายองค์ประกอบที่ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรม ซึ่งสร้างคาสเคดการแข็งตัวของเลือดแบบสมบูรณ์ที่พบในสารสกัดจากอะมีโบไซต์ของ Limulus ขึ้นใหม่ ในการทดสอบนี้ โปรตีนในคาสเคด ได้แก่ Factor C, Factor B และเอนไซม์ที่ส่งเสริมการแข็งตัวของเลือด จะทำปฏิกิริยากับเอนโดทอกซินตามลำดับ เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่สามารถวัดปริมาณได้ การทดสอบ r-CR จำลองกระบวนการ LAL ทั้งหมด แต่ไม่จำเป็นต้องใช้วัสดุที่มาจากสัตว์