โปรโตคอลการฉีดวัคซีน
ไลบรารี MISSION ® TRC shRNA เป็นคอลเลกชันเวกเตอร์ shRNA ที่ใช้ lentiviral สำหรับใช้ในการศึกษาแบบล้มลงของยีน โปรโตคอลนี้อธิบายถึงการใช้ อนุภาคมิชชั่น ® TRC shRNA lentiviral โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการปิดเสียงระยะยาวและการตรวจสอบ phenotypic ในเซลล์ระงับ โปรโตคอลต่อไปนี้ได้รับการพัฒนาจากวรรณคดี 1 สำหรับใช้ในเพลท 6 หลุมกับ อนุภาค lentiviral Mission ®
ระบบ ExpressMag ™ (SHM0 1 หรือ SHM02)ได้รับการปรับให้เหมาะสมกับเซลล์ระงับการถ่ายโอนในเวลาน้อยกว่าโปรโตคอลนี้ 24 ชั่วโมงและในรูปแบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหลายรูปแบบ
ไปที่โดยตรง
วัสดุ
มิชชั่น® อนุภาค lentiviral
ใช้ SHC002 VOR SHC001 Vสำหรับ การเพิ่มประสิทธิภาพโปรโตคอลการถ่ายโอน การถ่ายโอน SHC003 vcan จะถูกตรวจสอบผ่านทาง FACS หรือกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แต่โปรโตคอลสำหรับเรื่องนี้อยู่นอกขอบเขตของเอกสารนี้ การปรับโปรโตคอลของคุณให้เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญอันดับแรกเพื่อให้คุณมั่นใจในประสิทธิภาพการถ่ายโอนของคุณ ซึ่งจะลดปริมาณผลกระทบของเพย์โหลดเลนติไวรัส (ไม่ว่าจะเป็น shRNA หรือเพย์โหลดแบบกำหนดเอง) จากประสิทธิภาพการถ่ายโอน จากนั้นเมื่อเปลี่ยนไปใช้ MISSION® lentivirus ที่แสดงถึง SHRNA การเปลี่ยนแปลงจำนวนโคโลนีหรือเซลล์ที่ทำงานได้อาจเกิดจากผลกระทบของ SHRNA และไม่สามารถเกิดจากประสิทธิภาพการถ่ายโอนต่ำได้ หลังจากที่ประสิทธิภาพการถ่ายโอนได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้วให้ใช้ อนุภาคมิชชั่น ® เลนติไวรัสที่แสดงให้เห็นถึง shRNA ที่มุ่งเป้าไปที่ยี นที่คุณสนใจหรือใช้ acustom mission ® lentiviral partl ที่แสดงให้เห็นถึง shRNA หรือยีนที่คุณสนใจ
Puromycin (P9620)
สารละลายสต็อก 10 mg/mL สำหรับการเลือก
สื่อเต็มรูปแบบ
สำหรับ Jurkat Cells DME รวมถึงซีรัมวัวหรือสื่อของทารกในครรภ์ที่ไม่ได้รับความร้อน 10% สำหรับประเภทเซลล์ของคุณ
ฟ้าทริปแปน (93595)
12 x 15 มล. Conicals (CLS430790)
แผ่นวัฒนธรรมเนื้อเยื่อ 6 หลุม (CLS3516)
เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบแกว่งถัง
เครื่องหมุนเหวี่ยงควรติดตั้งการควบคุมอุณหภูมิและอุ่นไว้ที่ 32 º C ก่อนการถ่ายโอนเซลล์
Hemacytometer (Z359629)
Hemacytometer ใช้สำหรับการนับเซลล์
โปรโตคอล
- กำหนดความเข้มข้นของ puromycin สุดท้ายที่จะใช้ในการเลือก ความเข้มข้นที่แน่นอนขึ้นอยู่กับสายของเซลล์และควรได้รับการกำหนดโดยการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ไม่ได้รับการถ่ายโอน 72 ชั่วโมง
- ใช้เฉพาะสิ่งของที่ผ่านการฆ่าเชื้อและงานโดยใช้เทคนิคการปลอดเชื้อของเนื้อเยื่อมาตรฐานตลอดขั้นตอนนี้
- อุ่นสื่อทั้งหมดล่วงหน้าที่อุณหภูมิ 37°C
- นับเซลล์ Jurkat ที่มีการเพาะเลี้ยง
- เจือจางเซลล์ Jurkat ลงในขนาดกลางถึงขนาดสุดท้ายที่ มีความเข้มข้น 1x10 5 เซลล์/มล. ด้วยปริมาตรสุดท้าย 14 มล.
- ถ่ายภาพขนาด 1x10 5 เซลล์/มล. 2 มล. ลงในหลอดทรงกรวยขนาด 15 มล. ที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วหกหลอด
- เพิ่ม Mission® lentiviral particle solution ลงในเซลล์ Jurkat โดยมีค่าเท่ากับ 0 5.0 0.5 1.0 0.1 หรือ 10 ต่อกรวย 0 MOI แสดงถึงการควบคุมเชิงลบที่ไม่ผ่านการถ่ายโอนของคุณ
- ปั่นเหวี่ยงเซลล์ที่แรงเหวี่ยง 800 xg เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 32°C
- ไวรัสที่มีขนาดกลางจะถูกดูดและกำจัดอย่างเหมาะสมตามสถาบันของคุณ
- เม็ดเซลล์แต่ละเม็ดจะถูกนำกลับมาใช้ใหม่ในสื่อ 2 มล. โดยค่อยๆวางท่อเม็ดขึ้นและลงและเม็ดที่ถูกนำกลับมาใช้ใหม่แต่ละเม็ดจะถูกถ่ายโอนไปยังที่เก็บของตัวเองในแผ่นเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 6 หลุม
- จานจะถูกส่งกลับไปยังตู้บ่มเพาะเชื้อเนื้อเยื่อเป็นเวลาสามวัน
- หลังจาก 3 วันให้ถ่ายเซลล์ไปยัง 15 หลอดทรงกรวยขนาด 6 มล. และเม็ดที่ 200 xg เป็นเวลา 5 นาที นำสื่อบันทึกออกและใส่สื่อบันทึกที่มีส่วนผสมของ puromycin 2 มล. แทน
- นำแผ่นเพาะเชื้อเนื้อเยื่อไปเก็บไว้ที่ตู้บ่มเพาะข้ามคืน
- เซลล์จะถูกรักษาไว้ใน puromycin จนกว่าเซลล์ควบคุมลบที่ไม่ผ่านการถ่ายโอนจะเสียชีวิตตามที่กำหนดโดยการตรวจสอบหรือการย้อมสี Trypan Blue
หมายเหตุ
ใช้สมการด้านล่างเพื่อคำนวณ MOI ในบ่อ ViralTiter จะอยู่ในใบรับรองการวิเคราะห์ของคุณ VolumeofVirus คือปริมาตรในหน่วยมล. ที่เติมลงในหลอดเก็บตัวอย่าง/หลอดหมุนเหวี่ยงที่มีเซลล์ที่จะถ่ายโอนให้คุณ NumberofCells เท่ากับจำนวนรวมของเซลล์ที่ทำงานได้ในหลอดหมุนเหวี่ยง/หลุม
| โมอิ | = | ปริมาณไวรัส (TU/mL) x ปริมาณไวรัส (mL) |
| Number of Cells |