Oligonucleotide Melting Temperature
คุณจะคำนวณ TM ของ DNA ได้อย่างไร
อุณหภูมิหลอม(TM)ของ oligonucleotide คืออุณหภูมิที่ 50% ของ oligonucleotide ถูกทำซ้ำด้วยส่วนประกอบที่สมบูรณ์แบบและ 50% ฟรีในการแก้ปัญหา การตระหนักถึง TM มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อเทคนิคต่างๆในชีววิทยาระดับโมเลกุล (เช่น PCR, Southern blotting ใน การผสมข้ามพันธุ์ในไซต์) เทคนิคคลาสสิคบางอย่างเหล่านี้ยังคงใช้กันอย่างแพร่หลายร่วมกับเทคนิคใหม่ๆเช่นการเตรียมไลบรารี PCR เพื่อใช้ในการจัดลำดับรุ่นถัดไป
วิธีการทดลองที่พบมากที่สุดสำหรับการกำหนด TM คือการวัดการเปลี่ยนแปลงการดูดซึมของ oligonucleotide ด้วยส่วนประกอบของมันเป็นฟังก์ชั่นของอุณหภูมิ (รูปที่ 1) แม้ว่า ค่า TM ที่กำหนดโดยการทดลองจะมีความแม่นยำมากที่สุดแต่ก็ไม่จำเป็นต้องใช้เมื่อใช้เทคนิคระดับโมเลกุลแบบคลาสสิกสำหรับการใช้งานตามปกติ
รูปที่ 1 ตัวอย่างของการทดลองความมุ่งมั่นของ oligonucleotide TMการวัดจะทำในเซลล์ที่มีอุณหภูมิในเครื่องวัดสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-Vis TM คือค่าที่อ่านได้ครึ่งทางระหว่างดีเอ็นเอแบบดับเบิลเกลียว (DDNA) และดีเอ็นเอเดี่ยวเกลียว (SSSDNA)
วิธีการทางทฤษฎีที่คำนึงถึงเทคนิคที่ตั้งใจไว้เช่นเดียวกับปัจจัยที่มีผลต่อการละลาย (ความเข้มข้นของลำดับความยาวของลำดับองค์ประกอบฐานความแรงของไอออนิกฯลฯ) สามารถใช้ในการคำนวณ TMที่คาดหวัง
วิธีการคำนวณ DNA TM ทางทฤษฎี
ขึ้นอยู่กับลักษณะของลำดับเราใช้หนึ่งในสองวิธีในการคำนวณ TM:
- เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด
- พื้นฐาน
เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด
วิธีหลักที่เราใช้ในการคำนวณ TM เป็นวิธีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด1,2และเราใช้สำหรับ oligonucleotides ที่มีความยาวลำดับตั้งแต่ 15 ถึง 120 ฐาน (ขีดจำกัดความยาวสูงสุดของข้อเสนอมาตรฐาน DNA oligos ของเรา) วิธีการนี้ถือว่ามีความแม่นยำมากที่สุดเนื่องจากคำนึงถึงลำดับของ oligonucleotide มากกว่าองค์ประกอบพื้นฐานเช่นเดียวกับวิธีอื่นๆ วิธีเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดมีผลต่ออุณหพลศาสตร์รวม ถึงปัจจัยอื่นๆที่มีผลต่อ TM รวมถึงความเข้มข้นของ oligonucleotide และความเข้มข้นของไอออนบวกแบบโมโนวาเลนต์
เราใช้สูตรเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดที่ปรับเปลี่ยนต่อไปนี้:
โดยที่:
TM = อุณหภูมิหลอมเหลวใน°C
ΔH = การเปลี่ยนแปลง enthalpy ใน kcal mol-1 (บัญชีสำหรับการเปลี่ยนแปลงพลังงานในระหว่างการหลอม/หลอม)
A = ค่าคงที่ -0.0108 kcal K-1 ᐧ mol-1 (บัญชีสำหรับการเริ่มต้นเกลียวในระหว่างการหลอม/หลอม)
ΔS = การเปลี่ยนแปลงเอนโทรปีใน kcal K-1 ᐧ mol-1 (คิดเป็นพลังงานที่ไม่สามารถทำงานได้เช่นความผิดปกติ)
R = ค่าคงที่ของแก๊ส 0.00199 kcal K-1 ᐧ mol-1 (ค่าคงที่ที่ปรับระดับพลังงานต่ออุณหภูมิ)
C = ความเข้มข้นของ oligonucleotide ใน M หรือ mol L-1 (เราใช้ 0.0000005 เช่น 0.5 µM)
-273.15 = ปัจจัยการแปลงเพื่อเปลี่ยนอุณหภูมิที่คาดไว้ใน Kelvins เป็น°C
[Na+] = ความเข้มข้นของโซเดียมไอออนใน M หรือโมล L-1 (เราใช้ 0.05 เช่น 50 มม.)
มีจำนวนจำกัดของค่าเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดสำหรับ ΔH, ΔSและ , whic HCan เสียบโดยตรงเข้ากับสูตรข้างต้น (ตารางที่ 1)
ตารางที่ 1 ค่าใกล้เคียงที่สุดสำหรับ ΔH และ ΔS ในกระดาษที่ทำหน้าที่เป็นแหล่งที่มาสำหรับฐานเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดสูตร (อ้างอิง 1), ΔS, , และ หายากที่รายงานในหน่วยของ cal K 1 ᐧ mol 1 ดังนั้นตัวประกอบของ 1,000 จะคูณด้วย ΔH (รายงานเป็น kcal mol 1 ในสูตรเพื่อสร้างความสมดุลให้กับหน่วย ที่นี่เรารายงาน ΔS, Aและ Rin หน่วยของ kcal K 1 ᐧ โมล - 1 เพื่อให้หน่วยสำหรับแต่ละพารามิเตอร์ตรงกันและดังนั้นให้ทำการคำนวณตัวอย่างด้านล่างใช้งานง่ายขึ้นในระหว่างการวิเคราะห์มิติ โดยไม่คำนึงถึงวิธีการ T ที่คำนวณไม่ เหมือนกัน สำหรับรายการที่สมบูรณ์ของ ΔH และ ΔS ค่ารวมทั้งลำดับ wobble โปรดติดต่อฝ่ายบริการทางเทคนิคของเรา Grou PA toligotechserv@sial.com
* ลำดับด้านซ้ายคือ 5 ' ถึง 3 ' ในขณะที่ลำดับด้านขวาคือ 3 ' ถึง 5 ' เช่นสำหรับ AA/TT AA คือ 5 ' ถึง 3 ' และ TT คือ 3 ' ถึง 5 ' เมื่อเลือกค่าให้เลือกในทิศทาง 5 ถึง 3 ' เสมอไม่ว่าจะเป็นลำดับซ้ายหรือขวาในทิศทางที่ถูกต้อง
** ค่าเชิงลบสะท้อนให้เห็นว่าการหลอมเป็นไปอย่างกระตือรือร้นและเป็นที่นิยมอย่างมาก ค่าบวกจะสะท้อนถึงปฏิกิริยาย้อนกลับการละลายและจะนำไปสู่การ คำนวณ TM ที่เหมือนกัน
การคำนวณตัวอย่างเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด ตัวอย่างนี้จะสาธิตการคำนวณ TM ด้วยตนเอง ตามลำดับต่อไปนี้:
5 '-AAAAACCCGGGGGTTTTT 3 '
This is the above sequence paired with its reverse complement:
5 '-AAAAACCCGGGGGTTTTT 3 '
3 '-TTTTTGGGGGCCCAAAA- 5 '
ขั้นตอนที่หนึ่ง: ระบุค่าเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดสำหรับ ΔH และ ΔS และรวมแต่ละพารามิเตอร์
การอ่านค่า ΔH ดับเป้าหมาย 5 ' ถึง 3 ' ค่า ΔS และ สำหรับเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดทั้งหมดสามารถดูได้ในตารางที่ 1 คู่เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดที่ระบุพร้อมกับค่า ΔH และ ΔS (และผลรวม) มีดังนี้:
ขั้นตอนที่สอง: เสียบค่าลงในสูตรเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดเพื่อคำนวณอุณหภูมิหลอมเหลว
TM = 69.6 °C
เมื่อเปรียบเทียบนี่คือค่าที่กำหนดโดยเครื่องคิดเลขลำดับ oligonucleotide ออนไลน์:
ค่าที่คำนวณด้วยตนเองคือ 69.6 และค่าที่คำนวณได้ของเครื่องคิดเลขออนไลน์คือ 69.7 (ความคลาดเคลื่อนคือค่าต้นฉบับที่เขียนไว้สำหรับค่าคงที่ก๊าซของ 1.987 ถูกปัดเศษเป็น 1.99 สำหรับการคำนวณตัวอย่างนี้)
ค่าของ 69.7 จะแสดงบนแผ่นข้อมูลทางเทคนิคที่ให้มาพร้อมกับ oligonucleotide นี้
พื้นฐาน
วิธีที่สองที่เราใช้ในการคำนวณ TM คือวิธีการพื้นฐาน (สูตร Marmur Doty3ที่ได้รับการดัดแปลง) ซึ่งเราใช้สำหรับ oligonucleotides ที่มีความยาวลำดับสั้นๆเช่นที่มีฐาน 14 หรือน้อยกว่า ส่วนหนึ่งมาจากการทดลองการผสมเยื่อหุ้มเซลล์วิธีการนี้จะใช้ความเข้มข้นของไพรเมอร์ 50 นิวตันเมตรความเข้มข้นของไอออนโมโนวาเลนต์ (Na +) 50 มม. และ pH 7.0 เนื่องจากการทดลองการผสมเยื่อหุ้มเซลล์ไม่ได้ดำเนินการโดยทั่วไปในปัจจุบันเช่นเดียวกับกรณีที่เมื่อหลายทศวรรษที่ผ่านมาเมื่อการวิจัยนี้ได้ดำเนินการครั้งแรกปัจจัยการแก้ไขบัญชีสำหรับ oligonucleotide มีแนวโน้มที่จะเป็นอิสระในการแก้ปัญหาเช่นใช้ในเทคนิคร่วมสมัยมากขึ้นเช่น PCR
เราใช้สูตร Marmur Dota ที่ได้รับการแก้ไขต่อไปนี้:
TM = 2 (A + T) + 4 (C + G) - 7
โดยที่:
TM = อุณหภูมิหลอมเหลวใน°C
A = จำนวนของนิวคลีโอไทด์ adenosine ในลำดับ
T = จำนวนนิวคลีโอไทด์ของ thymidine ในลำดับ
C = จำนวนของนิวคลีโอไทด์ไซตินในลำดับ
G = จำนวนนิวคลีโอไทด์ของ guanosine ในลำดับที่
-7 = ปัจจัยการแก้ไขบัญชีสำหรับในสารละลาย
การคำนวณตัวอย่างปริมาณ Marmur ตัวอย่างนี้จะสาธิตการคำนวณ T mfor ด้วยตนเองตามลำดับต่อไปนี้:
5 '-ACGTCCGACT- 3 '
ขั้นตอนที่หนึ่ง: เสียบค่าลงในสูตร Marmur Dota เพื่อคำนวณอุณหภูมิหลอมเหลว
TM = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
TM = 2 (2 + 3) + 4 (4 + 3) - 7
TM = 31.0 °C
เมื่อเปรียบเทียบนี่คือค่าที่กำหนดโดยเครื่องคิดเลขลำดับ oligonucleotide ออนไลน์:
ค่าของ 31.0 จะแสดงบนแผ่นข้อมูลทางเทคนิคที่ให้มาพร้อมกับ oligonucleotide นี้
หากคุณตั้งใจที่จะใช้ oligonucleotides สั้นๆสำหรับการทดลองการผสมเยื่อหุ้มเซลล์เราขอแนะนำให้เพิ่ม +7 ด้วยตนเองไปยัง th eDisplayed TM(เช่นค่าข้างต้นจะเป็น 38°C)
สรุป
หนึ่งในสองวิธีนี้ใช้ในการกำหนด TM ของ oligonucleotide และเหมาะสำหรับเทคนิคระดับโมเลกุลแบบคลาสสิก หากต้องการความช่วยเหลือเพิ่มเติมโปรดปรึกษาฝ่ายบริการทางเทคนิคของเรา Grou PA toligotechserv@sial.com..