ขั้นตอนและวิธีการเรียงลำดับความโกรธ
What is Sanger Sequencing?
การเรียงลำดับความโกรธหรือที่เรียกว่า " วิธีการสิ้นสุดของโซ่ " เป็นวิธีการในการกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอ วิธีการนี้ได้รับการพัฒนาโดยผู้ได้รับรางวัลโนเบลสองครั้ง Frederick Sanger และเพื่อนร่วมงานของเขาในปี 1977 ดังนั้นจึงเป็นชื่อ ของลำดับ Sanger
หากต้องการตรวจสอบโครงสร้างทั่วไปของ DNA โปรดดู รูปที่ 2
การเรียงลำดับความโกรธทำงานอย่างไร ?
การเรียงลำดับความโกรธสามารถดำเนินการด้วยตนเองหรือโดยทั่วไปในรูปแบบอัตโนมัติผ่านทางเครื่องจัดลำดับ (รูปที่ 1) แต่ละวิธีจะเป็นไปตามสามขั้นตอนพื้นฐานตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
รูปที่ 1ขั้นตอนพื้นฐานสามขั้นตอนของการเรียงลำดับความโกรธอัตโนมัติ
ขั้นตอนการจัดลำดับความโกรธ
มีสามขั้นตอนหลักในการจัดลำดับความโกรธ
1. ลำดับดีเอ็นเอสำหรับ PCR การเลิกจ้างโซ่
ลำดับดีเอ็นเอของความสนใจจะถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับชนิดพิเศษของ พีซี Rcall-termination PCR PCR การเลิกจ้างแบบลูกโซ่ทำงานเหมือนกับ PCR มาตรฐานแต่มีความแตกต่างที่สำคัญอย่างหนึ่งคือการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ที่ปรับเปลี่ยนแล้ว (dNTPs) ที่เรียกว่า dideoxyribonucleotides (ddntps) ในขั้นตอนการขยายตัวของ PCR มาตรฐาน DNA polymerase จะเพิ่ม dNTPs ให้กับเส้นใย DNA ที่เพิ่มขึ้นโดยการเร่งปฏิกิริยาการก่อตัวของพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ระหว่างกลุ่ม 3 '-OH ฟรีของนิวคลีโอไทด์สุดท้ายและ 5 '-phosphate ของ th enext (รูปที่ 2)
ใน PCR การสิ้นสุดแบบลูกโซ่ผู้ใช้ผสม dNTP ที่มีการสิ้นสุดแบบลูกโซ่ในอัตราส่วนที่ต่ำเข้ากับ dNTP ปกติในปฏิกิริยา PCR ddntps ขาด กลุ่ม 3 '-O ที่จำเป็นสำหรับการ สร้างโพลิเมอร์ฟอสฟอสโฟไดเอสเทอร์ดังนั้นเมื่อดีเอ็นเอพอลิเมอเรสรวม dnTP แบบสุ่มการขยายสิ้นสุดลง ผลของ PCR การเลิกจ้างแบบลูกโซ่คือสำเนาของลำดับดีเอ็นเอที่น่าสนใจของ oligonucleotide นับล้านถึงพันล้านชุดซึ่งถูกยกเลิกด้วยความยาวแบบสุ่ม (n) โดย 5 '-dNTPs
การจัดลำดับความรุนแรงด้วยมือจะมีการสร้างปฏิกิริยา PCR สี่ปฏิกิริยาโดยแต่ละปฏิกิริยาจะมี ddNTP (DdATP, dTTP, dDGTP และ dDCTP) เพียงชนิดเดียว
การจัดลำดับตัวจัดการอัตโนมัติ dddntp ทั้งหมดจะถูกผสมในปฏิกิริยาเดียวและแต่ละ dntps ทั้งสี่จะมีฉลากเรืองแสงที่ไม่ซ้ำกัน
2. แยกขนาดโดยเจล Electrophoresis
ในขั้นตอนที่สอง oligonucleotides ที่สิ้นสุดด้วยโซ่จะถูกแยกออกจากกันด้วยขนาดผ่านทางอิเล็กโตรโฟเรซิสเจล ในเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสตัวอย่างดีเอ็นเอจะถูกโหลดเข้าไปในปลายด้านหนึ่งของเมทริกซ์เจลและมีการใช้กระแสไฟฟ้าดีเอ็นเอจะมีประจุลบดังนั้น oligonucleotides จะถูกดึงไปทางขั้วบวกที่ด้านตรงข้ามของเจล เนื่องจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอทั้งหมดมีประจุต่อหน่วยมวลเท่ากันความเร็วที่ oligonucleotides เคลื่อนที่จะถูกกำหนดตามขนาดเท่านั้น ส่วน A ที่เล็กกว่าคือแรงเสียดทานที่น้อยกว่าจะเกิดขึ้นเมื่อเคลื่อนที่ผ่านเจลและยิ่งเร็วขึ้น ดังนั้น oligonucleotides จะถูกจัดเรียงจากเล็กที่สุดไปใหญ่ที่สุดอ่านเจลจากด้านล่างไปด้านบน
ฉัน ยังไม่ได้ จัดลำดับความรุนแรงของสแปงเกอร์, oligonucleotides จากแต่ละปฏิกิริยา PCR ทั้งสี่จะทำงานในช่องที่แยกจากเจลสี่ช่อง ซึ่งจะช่วยให้ผู้ใช้ทราบว่า oligonucleotides ใดที่สอดคล้องกับ ddNTP แต่ละตัว
ฉัน ไม่มี การเรียงลำดับความโกรธโดยอัตโนมัติ oligonucleotides ทั้งหมดจะทำงานในอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลเส้นเลือดฝอยเดียวภายในเครื่องจัดลำดับ
3. การวิเคราะห์เจลและการกำหนดลำดับดีเอ็นเอ
ขั้นตอนสุดท้ายก็คือการอ่านเจลเพื่อหาลำดับของดีเอ็นเออินพุต เนื่องจากดีเอ็นเอพอลิเมอเรสสังเคราะห์ดีเอ็นเอในทิศทาง 5 ' ถึง 3 ' โดยเริ่มต้นที่ไพรเมอร์ที่ให้มาเทอร์มินัล ddNTP แต่ละตัวจะสอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์เฉพาะในลำดับเดิม (เช่นส่วนที่สั้นที่สุดต้องสิ้นสุดที่นิวคลีโอไทด์แรกจากปลาย 5 ส่วนที่สั้นที่สุดเป็นอันดับสองต้องสิ้นสุดที่นิวเคลียสที่สองจากปลาย 5 ' ฯลฯ) ดังนั้นด้วยการอ่านแถบเจลจากเล็กที่สุดไปใหญ่ที่สุดเราสามารถกำหนดลำดับ 5 ' ถึง 3 ' ของสาย DNA ดั้งเดิม
ฉัน nmanual Sanger sequencing ผู้ใช้อ่านทั้งสี่เลนของเจลในครั้งเดียวโดยเลื่อนลงด้านล่างไปด้านบนโดยใช้เลนเพื่อกำหนดรหัสประจำตัวของเทอร์มินัล ddnTP สำหรับแต่ละแบนด์ ตัวอย่างเช่นหากพบแถบด้านล่างในคอลัมน์ที่ตรงกับ ddGTP ชิ้นส่วน PCR ที่เล็กที่สุดจะสิ้นสุดลงด้วย ddGTP และนิวคลีโอไทด์แรกจากปลายปี 5 ของลำดับเดิมจะมีฐาน guanine (G)
การจัดลำดับตัวเปลี่ยนอัตโนมัติคอมพิวเตอร์จะอ่านแต่ละวงของเจลเส้นเลือดฝอยตามลำดับโดยใช้ฟลูออเรสเซนซ์เพื่อเรียกตัวตนของเทอร์มินัล ddNTP แต่ละตัว กล่าวโดยสรุปคือเลเซอร์จะสร้างความตื่นเต้นให้กับแท็กฟลูออเรสเซนต์ในแต่ละแบนด์และคอมพิวเตอร์จะตรวจจับแสงที่ได้ เนื่องจาก ddntp ทั้งสี่ตัวถูกติดป้ายฟลูออเรสเซนต์ที่แตกต่างกันแสงที่ปล่อยออกมาจึงสามารถเชื่อมโยงกับตัวตนของเทอร์มินัล dnTP ได้โดยตรง เอาต์พุตเรียกว่าโครมาโตแกรมซึ่งแสดงยอดฟลูออเรสเซนต์ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวตามความยาวของดีเอ็นเอเทมเพลต
รูปที่ 2แผนผังโครงสร้าง DNA ดีเอ็นเอเป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยสองเส้นที่ขดลวดรอบๆกันและกันเพื่อสร้างเกลียวคู่ แต่ละเส้นประกอบด้วยสตริงของโมเลกุลที่เรียกว่า deoxyribonucleotides (dNTPs)
dNTP แต่ละตัวมีกลุ่มฟอสเฟตกลุ่มน้ำตาลและหนึ่งในสี่ฐานไนโตรเจน [adenine (A), thymine (T), guanine (G) หรือ cytosine (C)] dNTPs ถูกรัดเข้าด้วยกันในรูปแบบเชิงเส้นโดยพันธะโควาเลนต์ของฟอสฟอสโฟไดเอสเตอร์ระหว่างน้ำตาลของ dNTP หนึ่งและกลุ่มฟอสเฟตของถัดไปรูปแบบน้ำตาลฟอสเฟตซ้ำๆนี้ทำให้เกิดกระดูกสันหลังน้ำตาลฟอสเฟต
ฐานไนโตรเจนของสองเส้นที่แยกจากกันจะถูกผูกเข้าด้วยกันโดยพันธะไฮโดรเจนระหว่างฐานเสริมเพื่อสร้างเกลียวดีเอ็นเอสองเกลียว
วิธีการอ่านผลการเรียงลำดับความโกรธ
การอ่านผลการจัดลำดับความโกรธอย่างถูกต้องจะขึ้นอยู่กับว่าดีเอ็นเอสองเส้นใดที่น่าสนใจและมีสีรองพื้นอะไรบ้าง ถ้าดีเอ็นเอสองเส้นเป็น A และ B และเกลียว A เป็นสิ่งที่น่าสนใจ แต่สีรองพื้นจะดีกว่าสำหรับเกลียว B ส่วนของเอาต์พุตจะเหมือนกับเกลียว A ในทางกลับกันหากเกลียว A มีความสนใจและสีรองพื้นดีกว่าสำหรับเกลียว A จากนั้นเอาต์พุตจะเหมือนกับเกลียว B ดังนั้นเอาต์พุตจะต้องถูกแปลงกลับไปเป็นเกลียว A
ดังนั้นหากลำดับของความสนใจอ่าน "TACG" และไพรเมอร์ที่ดีที่สุดสำหรับสาระที่เอาท์พุทจะเป็น "ATGC" และดังนั้นจึงต้องแปลงกลับไปเป็น "TACG" อย่างไรก็ตามหากไพรเมอร์ดีกว่าสำหรับสาระเสริม ("ATGC") ผลลัพธ์จะเป็น "TACG" ซึ่งเป็นลำดับที่ถูกต้อง
ในระยะสั้น, ก่อนที่จะเริ่มต้น, คุณจำเป็นต้องรู้ว่าสิ่งที่คุณกำลังกำหนดเป้าหมายและวิธีการที่คุณจะได้รับมี ! ดังนั้นโปรดจำไว้ว่านี่คือตัวอย่างของตัวอย่างเดิม (TACG -> ATGC -> TACG) หากป้ายชื่อของ dideoxynucleotides เป็น T = สีเหลือง, A = สีชมพู, C = สีน้ำเงินเข้มและ G = สีฟ้าอ่อนคุณจะได้รับลำดับสั้นๆรองพื้น -A, ไพรเมอร์ -ATG, ไพรเมอร์ -ATG และไพรเมอร์ -ATGC เมื่อชิ้นส่วนถูกแยกออกจากกันด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสเลเซอร์จะอ่านชิ้นส่วนตามลำดับความยาว (สีชมพู, สีเหลือง, สีฟ้าอ่อนและสีฟ้าเข้ม) และสร้างโครมาโตแกรม คอมพิวเตอร์จะแปลงตัวอักษรดังนั้นลำดับสุดท้ายคือ TACG ที่ถูกต้อง
การเรียงลำดับความโกรธเทียบกับ PCR
การเรียงลำดับความโกรธและ PCR ใช้วัสดุเริ่มต้นที่คล้ายกันและสามารถใช้ร่วมกันได้แต่ไม่สามารถแทนที่กันได้
PCR is used to amplify DNA in its entirety. แม้ว่าชิ้นส่วนที่มีความยาวแตกต่างกันอาจเกิดขึ้นโดยบังเอิญ (เช่น DNA polymerase อาจหลุดออกมา) เป้าหมายคือการทำซ้ำลำดับ DNA ทั้งหมด ด้วยเหตุนี้“ส่วนผสม”คือดีเอ็นเอเป้าหมายนิวคลีโอไทด์ดีเอ็นเอไพรเมอร์และดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (โดยเฉพาะโพลิเมอร์ Taq ซึ่งสามารถอยู่รอดได้ในอุณหภูมิสูงที่จำเป็นใน PCR)
ในทางกลับกันเป้าหมายของการจัดลำดับความเป็นตัวเปลี่ยนคือการสร้าง DNA ที่มีความยาวเท่าที่จะเป็นไปได้จนถึงความยาวเต็มของ DNA เป้าหมาย นั่นคือเหตุผลที่นอกเหนือจากวัสดุเริ่มต้น PCR จำเป็นต้องใช้ dideoxynucleotides
การเรียงลำดับความโกรธและ PCR สามารถนำมารวมกันเมื่อสร้างวัสดุเริ่มต้นสำหรับโปรโตคอลการเรียงลำดับความโกรธ PCR สามารถใช้ในการสร้างสำเนาของดีเอ็นเอจำนวนมากที่จะถูกจัดลำดับ
การมีเทมเพลตมากกว่าหนึ่งเทมเพลตที่จะทำงานจากทำให้โปรโตคอลของผู้จัดการมีประสิทธิภาพมากขึ้น หากลำดับเป้าหมายเป็น 1,000 นิวคลีโอไทด์ยาวและมีเพียงหนึ่งสำเนาของแม่แบบก็จะใช้เวลานานกว่าในการสร้างชิ้นส่วนที่ติดแท็ก 1,000 อย่างไรก็ตามหากมีสำเนาของแม่แบบหลายชุดในทางทฤษฎีจะใช้เวลาน้อยลงในการสร้างชิ้นส่วนที่ถูกแท็กทั้ง 1,000 ชิ้น
สินค้าที่เกี่ยวข้อง
เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่
ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?