วิธีการ LC/MS/MS สำหรับการกำหนด glyphosate, AMPA และ glufosinate ในธัญพืช
บทนำ
Glyphosate เป็นหนึ่งในสารกำจัดวัชพืชที่ใช้กันมากที่สุดในโลก การใช้งานของมันเพิ่มขึ้นอย่างมากหลังจากการแนะนำของพืชที่ทนต่อการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมเช่นข้าวโพดถั่วเหลืองและฝ้าย ปัจจุบันมีการใช้ Glyphosate มากกว่า 1.4 พันล้านปอนด์กับเขตข้อมูลต่อปี1 เอกสารระเบียบข้อบังคับของ US EPA CFR-TITLE 40 เล่ม 24 ตั้งค่าระดับความคลาดเคลื่อนสำหรับการเกิด glyphosate ในสินค้าโภคภัณฑ์อาหารและผลผลิต2
ระดับความคลาดเคลื่อน EPA สำหรับสารตกค้างของ Glyphosate ในธัญพืช (หรือเรียกอีกอย่างว่ากลุ่มพืชผล 15 มีการตั้งค่าไว้ที่ 30 ppm ซึ่งไม่รวมข้าวถั่วเหลืองและข้าวโพด ในข้าวความอดทนคือ 0.1 ppm ในขณะที่ข้าวโพดหวานมันเป็น 3.5 ppm2 สำหรับ glucofosinate สารกำจัดวัชพืชที่มักรวมอยู่ใน glyphosate ในวิธีการวิเคราะห์ค่าความคลาดเคลื่อนคือ 0.4 ppm สำหรับธัญพืชและ 1.0 ppm สำหรับข้าว ค่าความคลาดเคลื่อนเหล่านี้รวมถึงเมตาบอไลต์และการย่อยสลาย ดังนั้น glyphosate metabolite (aminomethyl) -phosphonic acid (AMPA) จึงรวมอยู่ในการศึกษานี้ด้วย (รูปที่ 1)
รูปที่ 1 โครงสร้างของ glyphosate, AMPA และ glufosinate
เนื่องจาก glyphosate ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการผลิตถั่วเหลืองและข้าวโพดจึงคาดว่าจะพบได้ในสินค้าเหล่านี้ ในโปรแกรมนี้เรามุ่งเน้นไปที่การสำรวจการปรากฏตัวของ glyphosate ในธัญพืชอื่นๆ (ข้าวโอ๊ตและข้าวสาลี) ที่ใช้ในการทำซีเรียลอาหารเช้ารวมทั้งผลิตภัณฑ์ธัญพืชสำหรับทารก
วิธีการต่างๆสำหรับการวิเคราะห์ glyphosate ได้รับการพัฒนาในช่วง 30 ปีที่ผ่านมา การได้มาของ analytes ที่ต้องการสำหรับ HPLC ที่มีการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์กับ Ho -phthalaldehyde3 วิธีการที่มีการสร้าง glyphosate โดยใช้ fluorenylmethyloxycarbonyl คลอไรด์ (FMOC) และการตรวจจับฟลูออเรสเซนซ์ได้รับการเสนอและใช้โดยห้องปฏิบัติการบางแห่ง4 เมื่อเร็วๆนี้ด้วยการถือกำเนิดของเครื่องมือ LC/MS/MS ที่ทันสมัยมีความไวและทนทานมากขึ้นทำให้สามารถวิเคราะห์ glyphosate และ metabolites ได้โดยไม่ต้องมีการสร้างอนุพันธ์ เราใช้การวิเคราะห์โดยตรงของ glyphosate โดย MS/MS ในงานนี้
ทดลอง
เพื่อยืนยันประสิทธิภาพของวิธีการใช้ข้าวโอ๊ตทันทีอินทรีย์และแป้งข้าวสาลีอินทรีย์ อาหารเหล่านี้ถูกสแกนเพื่อหาการปรากฏตัวของ glyphosate และไม่พบ แป้งสาลีทั้งหมดถูกใช้ตามสภาพที่เป็นอยู่และข้าวโอ๊ตอย่างรวดเร็วถูกบดก่อนที่จะใช้ สำหรับการศึกษาประสิทธิภาพของเมธอดมีการเติมเมทริกซ์ทั้งสองให้มี Glyphosate 100 ppb และ Glufosinate 100 ppb
นอกจากนี้ยังมีการเติมข้าวโอ๊ตเพื่อบรรจุ AMPA 100 ppb ด้วย แป้งข้าวโพดอินทรีย์ถูกซื้อและทดสอบสำหรับ glyphosate และพบว่าไม่มี glyphosate วิธีการเดียวกันนี้ยังสามารถนำไปใช้ในการทดสอบแป้งข้าวโพดและผลิตภัณฑ์ข้าวโพด
สำหรับการศึกษาคัดกรองเมทริกซ์ต่อไปนี้ใช้วิธีการที่พัฒนาแล้วและได้รับการทดสอบสำหรับ glyphosate: แป้งสีขาวข้าวโอ๊ตทันทีธัญพืชข้าวสำหรับทารกข้าวโอ๊ตสำหรับทารกและธัญพืชผสมสำหรับทารก
Sample Pre-treatment
วิธีการสกัดขึ้นอยู่กับวิธีการ QuPPe (Quick Polar Pesticides Method) ที่พัฒนาขึ้นในสหภาพยุโรป (EU) สำหรับผักและผลไม้และน้ำที่ใช้: เมทานอล (50: 50) ที่มีกรดฟอร์มิกเป็นตัวทำละลายสกัดขั้นสุดท้าย5 มีการชั่งน้ำหนักตัวอย่างธัญพืชหรือธัญพืชที่เป็นเนื้อเดียวกันห้ากรัมลงในหลอดปั่นเหวี่ยงขนาด 50 มล. เติมน้ำ 10 มล.) และ 100 μL ของสารละลายมาตรฐานภายใน (น้ำ 20 ไม μg รกรัม/มล. ของสารวิเคราะห์แต่ละชนิดในน้ำ) จากนั้นจึงทิ้งตัวอย่างไว้ 30 นาทีถึงสองชั่วโมง หลังจากนั้นมีการเพิ่มเมทานอล 10 มล. ที่มีกรดฟอร์มิค 1 โวลต์/โวลต์ ตัวอย่างถูกผสมเป็นเวลา 15 นาทีบนเครื่องปั่นในห้องปฏิบัติการและปั่นเหวี่ยง สองตัวอย่างที่ใช้ในระหว่างการตรวจสอบข้าวโอ๊ตและข้าวสาลีให้สารสกัดที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ข้าวโอ๊ตผลิตสารสกัดสีเหลืองที่ชัดเจนสารสกัดจากข้าวสาลีมีเมฆมากและยากที่จะกรอง ดังนั้นจึงมีการใช้ขั้นตอนการทำความสะอาดตัวอย่างสองขั้นตอนที่แตกต่างกันสำหรับตัวอย่างธัญพืชที่แตกต่างกัน
การล้างตัวอย่างโดยใช้ SPE
สำหรับตัวอย่างที่ไม่มีอนุภาคหลังจากการสกัดและการปั่นเหวี่ยงจะใช้การทำความสะอาดแบบโซลิดเฟส (SPE) โดยใช้ Supel ™ - เลือกตลับ HLB คล้ายกับวิธีการที่ Chamkasem และ Harmon รายงาน6 ตลับหมึก HLB ถูกปรับสภาพโดยใช้เมทานอล 100% ตามด้วยน้ำ: เมทานอล (50: 50) ที่มีกรดฟอร์มิก 0.5% v/v สำหรับตลับ SPE ขนาด 1 มล. จะใช้สารสกัดตัวอย่างขนาด 0.5 มล. เพื่อปรับสภาพตลับหมึกเพิ่มเติม การหลุดออกจากขั้นตอนการปรับสภาพนี้ถูกยกเลิก ใส่ตัวอย่างที่สองของสารสกัดตัวอย่าง 0.5 มล.) ลงในตลับ HLB ตัวกรองนี้ถูกเก็บรวบรวมและกรองผ่านหลอดกรองเมมเบรนโพลีโพรพิลีนขนาด 0.2 ไมครอน
การล้างตัวอย่างโดยใช้การกรองแบบ Ultrafiltration
อุปกรณ์กรองแบบ Ultrafiltration ใช้สำหรับทำความสะอาดสารสกัดตัวอย่างเช่นข้าวสาลีที่มีอนุภาคหลังจากขั้นตอนการปั่นเหวี่ยง เมมเบรน polyethersulfone ที่ 3 kDA การตัดน้ำหนักโมเลกุล (MWCO) ถูกนำมาใช้ในงานปัจจุบัน เยื่อหุ้มได้รับการปรับสภาพล่วงหน้าโดยผ่านตัวทำละลายสกัด 0.5 มล. ผ่านโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 4000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีเพื่อให้เวลาในการเก็บรักษาของ glyphosate สอดคล้องกัน ตัวทำละลายที่ส่งผ่านนี้ถูกทิ้งและโหลดสารสกัดตัวอย่าง 1 มล. ขั้นตอนการกรองด้วยการปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 45 นาทีที่ 4000 รอบต่อนาที นอกจากนี้ยังได้รับการพิจารณาว่าอุปกรณ์กรองที่มีเมมเบรนเซลลูโลสที่สร้างขึ้นใหม่เช่นตัวกรองแรงเหวี่ยง Amicon ™ที่มี 3 KDA MWCO สามารถใช้ในขั้นตอนนี้ได้โดยไม่ต้องปรับสภาพ ตัวอย่างที่ชัดเจนที่ผ่านเมมเบรนได้รับการเก็บและวิเคราะห์ สำหรับการวิเคราะห์ขวดที่มีการดูดซึมต่ำถูกนำมาใช้เพื่อป้องกันการสูญเสียของ analytes บนพื้นผิวกระจก
Sample Preparation for Beer
ตัวอย่างเบียร์สามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้วิธีการเดียวกัน ประการแรกการกำจัดก๊าซเบียร์อย่างละเอียดได้รับการดำเนินการโดยการวางตัวอย่างเบียร์ในอ่างอัลตราโซนิกเป็นเวลา 15 นาที จากนั้นตัวอย่างเบียร์ 5 มล. ผสมกับเมทานอล 5 มล. ที่มีกรดฟอร์มิค 1 เปอร์เซ็นต์และมาตรฐานภายใน ตัวอย่างนี้ได้รับการผสมและทำความสะอาดเป็นเวลาสั้นๆโดยใช้ขั้นตอน SPE
วิธีการ LC/MS/MS
คอลัมน์ HPLC ที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์นี้คือ apHera ™ NH 2 คอลัมน์ซึ่งมีการแยก LC ที่เสถียรและมีประสิทธิภาพจาก pH 2 ถึง 13 การไล่ระดับสีเฟสมือถือใช้น้ำและแอมโมเนียมคาร์บอเนตที่ pH 9 เฟสเคลื่อนที่นี้ทำให้มั่นใจได้ว่ามีการสร้างไอออนที่เหมาะสมของ glyphosate ซึ่งมีกลุ่มฟอสเฟตในโครงสร้างโดยมีการตรวจจับภายใต้เงื่อนไข ESI เชิงลบ นอกจากนี้บัฟเฟอร์แอมโมเนียมคาร์บอเนตยังระเหยได้และเข้ากันได้กับเครื่องมือ LC/MS ตารางที่ 1 แสดงเงื่อนไข MS สำหรับ Analyte ทั้งหมดและ รูปที่ 2 แสดงโครมาโตแกรมของการฉีดมาตรฐาน ดำเนินการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องมือ AB Sciex QTrap 3200 ความไวของวิธีการแบบจำกัดนี้ อย่างไรก็ตามดังที่เห็นด้านล่างวิธีการนี้สามารถวัดปริมาณการปนเปื้อนของ glyphosate ในตัวอย่างส่วนใหญ่ในการศึกษานี้ได้
ผลลัพธ์
ประสิทธิภาพของวิธีการ
ทั้งวิธีการทำความสะอาดแบบ SPE และแบบ Ultrafiltration ทำให้สามารถทำความสะอาดตัวอย่างได้ดีและสามารถทำการวิเคราะห์ LC/MS ได้ ในข้าวโอ๊ตตรวจพบการวิเคราะห์ทั้งสามแบบและวัดค่าที่ 100 ppb ในแป้งสาลี glyphosate และ glufosinate ได้รับการวัดที่ 100 ppb ผลลัพธ์ของการทดสอบวิธีจะแสดงใน ตารางที่ 2 วิธีการเก็บตัวอย่างข้าวสาลีทำให้เกิดความไม่แน่นอนที่สูงขึ้นเล็กน้อยสูงถึง 19% RSD วิธีการทำความสะอาดข้าวสาลีไม่ได้ใช้การทำความสะอาด SPE และพบว่าสัญญาณที่ได้มีการกำจัดไอออนสูงกว่าเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ทำความสะอาดโดยใช้ SPE เช่นข้าวโอ๊ต โดยทั่วไปแล้วระดับการกำจัดไอออนที่แตกต่างกันตั้งแต่ร้อยละ 50 ถึงร้อยละ 80 มีอยู่ในตัวอย่างทั้งหมดดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องใช้มาตรฐานภายในสำหรับการวัดปริมาณที่ถูกต้อง
รูปที่ 2การวิเคราะห์ LC/MC ของ Glyphostate, AMPA และ Glufosinate บน apHera NH2
Glyphosate ในเบียร์
ไม่พบสารวิเคราะห์ในเบียร์ที่ผ่านการทดสอบ ดังนั้นตัวอย่างเบียร์จึงถูกแทงที่ 50 ppb ด้วย glyphosate และ glufosinate และวิเคราะห์ ผลลัพธ์จะแสดงใน ตารางที่ 2 ในงานนี้เราไม่ได้พยายามคัดกรองเบียร์ต่อไป
การระบุและปริมาณของ glyphosate ในธัญพืช
ผลของปริมาณ glyphosate ในธัญพืชจะแสดงใน ตารางที่ 3 ตัวอย่างข้าวโอ๊ตทันที (รูปที่ 3 และแป้งสีขาวมี Glyphosate จำนวนมาก 1.2 และ 0.8 ppm ตามลำดับ ตัวอย่างข้าวโอ๊ตออร์แกนิกไม่มี Glyphosate ในปริมาณที่ตรวจพบได้ (รูปที่ 4) ธัญพืชสำหรับทารกมี glyphosate ในระดับต่ำมาก ระดับใกล้เคียงกับขีดจำกัดของความไวของเครื่องมือในเมทริกซ์และ RSD ที่ได้นั้นสูง ธัญพืชข้าวโอ๊ตสำหรับทารกมี glyphosate ที่ 1.1 ppm และพบว่าธัญพืชผสมสำหรับทารกมี glyphosate ที่ 0.25 ppm ไม่มีธัญพืชสำหรับทารกที่มีฉลากว่าออร์แกนิค Glufosinate was not found in any cereal products. AMPA พบเฉพาะในข้าวโอ๊ตทันทีในระดับต่ำ
รูปที่ 3Glyphosate ในทันที
รูปที่ 4ตัวอย่างข้าวโอ๊ตออร์แกนิค, ว่างเปล่าและเติมที่ glyphosate 100 ppb
บทสรุป
วิธีการที่นำเสนอที่พัฒนาขึ้นสำหรับ glyphosate และสารประกอบที่เกี่ยวข้องใช้การตรวจจับ LC/MS/MS และการแลกเปลี่ยนไอออนพอลิเมอร์ ที่ใช้ apHera NH 2 คอลัมน์ที่มีความเสถียรภายใต้สภาวะ pH ที่สูงขึ้น วิธีการเตรียมตัวอย่างได้รับการพัฒนาขึ้นเพื่อแยก glyphosate ออกจากผลิตภัณฑ์อาหารธัญพืช วิธีการรวมถึงการทำความสะอาดโดยใช้โพลีเมอร์เอสพีอีซึ่งนำไปใช้กับตัวอย่างธัญพืชรวมถึงข้าวโอ๊ตและผลิตภัณฑ์ธัญพืชสำหรับทารก การทำความสะอาดที่รวมถึงการกรองแบบละเอียดได้รับการพัฒนาสำหรับผลิตภัณฑ์ที่มีข้าวสาลีและนำไปใช้กับตัวอย่างแป้งสาลีได้สำเร็จ การใช้มาตรฐานที่มีการติดฉลากแบบไอโซโททอปทำให้มีความแม่นยำมากขึ้นในการกำหนด glyphosate และอนุญาตให้ใช้เส้นโค้งการสอบเทียบที่ใช้ตัวทำละลายโดยการชดเชยผลกระทบของไอออไนเซชันที่มีอยู่ในตัวอย่าง วิธีการพิสูจน์ตัวเองว่ามีความทนทานและทำงานได้ดีแม้ว่าจะใช้เครื่องมือที่เก่ากว่าและมีความไวน้อยกว่า