การคัดกรองและโปรโตคอลสีน้ำเงิน - ขาวสำหรับการเลือกอาณานิคม
การระบุแบคทีเรีย Recombinant
การคัดกรองสีฟ้า - ขาวเป็นเทคนิคที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพในการระบุแบคทีเรียที่รีคอมบิแนนท์ มันขึ้นอยู่กับกิจกรรมของ β -galactosidase เอนไซม์ที่เกิดขึ้นใน E. coliซึ่งแยกแลคโตสเป็นกลูโคสและกาแลคโตส
ทำลายยีน Lacz
การปรากฏตัวของแลคโตสในสภาพแวดล้อมโดยรอบทำให้เกิดแลคซีโอเปอร์ออนใน E. coli กิจกรรมของโอเปอร์อนส่งผลให้เกิดการผลิตเอนไซม์ β -galactoisdase ที่เผาผลาญแลคโตส เวกเตอร์ plasmid ส่วนใหญ่มีส่วนสั้นๆของยีน lacz ที่มีข้อมูลการเข้ารหัสสำหรับกรดอะมิโน 146 ตัวแรกของ β -galactosisdase โฮสต์ E. col istrains ที่ใช้เป็นเซลล์ที่มีความสามารถที่มีการกลายพันธุ์การลบ lacZΔM15 เมื่อ α เวกเตอร์ plasmid ถูกนำขึ้นโดยเซลล์ดังกล่าวเนื่องจากกระบวนการเสริม β เอนไซม์ทำงาน -galatosidase จะถูกผลิตขึ้น
เวกเตอร์ plasmid ที่ใช้ในการโคลนถูกจัดการในลักษณะที่กระบวนการเสริม α นี้ทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายสำหรับการรวมตัวกันใหม่ มีไซต์โคลนนิ่งหลายไซต์ (MCS) อยู่ภายในลำดับ LACZ ในเวกเตอร์ plasmid ลำดับนี้สามารถทำได้โดยการจำกัดเอนไซม์เพื่อแทรกดีเอ็นเอจากต่างประเทศ เมื่อเวกเตอร์ plasmid ที่มีดีเอ็นเอจากต่างประเทศถูกนำขึ้นโดยโฮสต์ E. coliการเสริม α ไม่เกิดขึ้นดังนั้นเอนไซม์ β -galactosidase ที่ใช้งานไม่ได้ หากไม่ได้ใส่ดีเอ็นเอจากต่างประเทศลงในเวกเตอร์หรือหากใส่ไว้ในตำแหน่งอื่นที่ไม่ใช่ MCS ยีน lacZ ในเวกเตอร์ plasmid จะช่วยเติมเต็มการกลายพันธุ์ของการลบ lacz ในโฮสต์ E. coll ซึ่งเป็นการผลิตเอนไซม์ที่ใช้งานได้
การคัดกรองสีฟ้าขาวทำงานอย่างไร ?
สำหรับการคัดกรองโคลนที่มีดีเอ็นเอ recombinant สารตั้งต้นโครโมจีนิกที่เรียกว่า X-gal จะถูกเพิ่มลงในแผ่นวุ้น หาก β -galactosidase ผลิต X-gal จะถูกไฮโดรไลซ์เพื่อสร้าง 5 โบรโม 4 chloro-indoxyl ซึ่งละลายโดยธรรมชาติเพื่อผลิตเม็ดสีฟ้าที่ไม่ละลายน้ำที่เรียกว่า 5,5 '-dibromo-4,4 '-dichloro-indigo โคโลนีที่เกิดจากเซลล์ที่ไม่ใช่รีคอมบิแนนท์จึงปรากฏเป็นสีฟ้าในขณะที่ตัวรีคอมบิแนนท์ปรากฏเป็นสีขาว สามารถเลือกและเพาะเลี้ยงอาณานิคม Recombinant ที่ต้องการได้อย่างง่ายดาย
Isopropyl MD-D-4-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) ใช้ร่วมกับ X-gal β รับการคัดกรองสีฟ้า - ขาว IPTG เป็นอะนาล็อกที่ไม่สามารถเผาผลาญได้ของกาแลคโตสที่ทำให้เกิดการแสดงออกของยีนแลคซี ควรสังเกตว่า IPTG ไม่ใช่สารตั้งต้นสำหรับ β -galactosidase แต่เป็นเพียงตัวกระตุ้นเท่านั้น สำหรับการคัดกรองด้วยสายตาจำเป็นต้องใช้สารตั้งต้นที่มีโครเมียมเช่น X-gal
รูปที่ 1การแสดงแผนผังของเวกเตอร์พลาสมิดทั่วไปที่สามารถใช้ในการคัดกรองสีฟ้า - ขาว
รูปที่ 2การแสดงแผนผังของขั้นตอนการคัดกรองสีฟ้า - ขาวทั่วไป
ผลิตภัณฑ์คัดกรองสีฟ้า - ขาว (วัสดุ)
โปรโตคอลสำหรับการคัดกรองสีฟ้า - ขาว
โครงการศึกษาที่สมบูรณ์ของการคัดกรองสีฟ้าขาวประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่สำคัญ:
- ligation: ligation ของดีเอ็นเอต่างประเทศเป็น MCS ของเวกเตอร์ plasmid
- การแปลง: การแนะนำเวกเตอร์ plasmid กับการแทรกดีเอ็นเอจากต่างประเทศเข้าไปใน E. coli ที่มีความสามารถ
- การคัดกรอง: การคัดกรองสีฟ้า - ขาวเพื่อระบุอาณานิคมแบคทีเรียที่เกิดขึ้นใหม่
การควบ
เรามีเวกเตอร์นิพจน์ที่พร้อมใช้ต่อไปนี้ซึ่งสามารถใช้สำหรับระบบนิพจน์ที่เสถียรและชั่วคราวได้ โครงสร้างธงฟิวชั่นเหล่านี้มีต้นกำเนิดของการจำลองแบบสำหรับการแพร่กระจายในเซลล์แบคทีเรียและสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
Materials required
ต่อไปนี้เป็นการตั้งค่าปฏิกิริยาสำหรับ ligation
- เติมส่วนประกอบทั้งหมดข้างต้นลงในหลอดปฏิกิริยาที่สะอาด
- บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 25°C (สามารถทำได้ในเทอร์โมไซเซอร์)
- µL ความสะอาดดีเอ็นเอโดยใช้คอลัมน์การล้าง PCR และ Elute ในประมาณ 50 μ m
- แปลงผลิตภัณฑ์ ligation 0.1-10 ng เป็นเซลล์เคมีหรือเซลล์ไฟฟ้าที่เข้ากันได้กับเวกเตอร์
การเปลี่ยนแปลง
พลาสมิดคุณภาพสูงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับขั้นตอนการเปลี่ยนแปลง ชุดต่อไปนี้แยกและทำให้พลาสติกคุณภาพสูงบริสุทธิ์เหมาะสำหรับการเปลี่ยนแปลง
โปรโตคอลรายละเอียดสำหรับการเปลี่ยนแปลงโดยใช้เซลล์เคมีหรือเซลล์ไฟฟ้าสามารถ foun dhere
การคัดกรอง
เรามีพื้นผิวโครโมจีนิกหลากหลายชนิดที่ช่วยในการคัดกรองแบคทีเรียรีคอมบิแนนท์ ผลิตภัณฑ์บางชนิดอาจใช้เพื่อกระจายบนแผ่น agar LB (การคัดกรองตามขั้นตอนที่ 1) ในขณะที่ผลิตภัณฑ์อื่นๆจะรวมอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย์ (การคัดกรองตามขั้นตอนที่ 2) ผลิตภัณฑ์จะถูกใช้พร้อมกับ IPTG เมื่อจำเป็น โปรโตคอลสำหรับทั้งสองขั้นตอนมีดังต่อไปนี้
โปรโตคอลการคัดกรอง 1 (ใช้ได้กับหมายเลขผลิตภัณฑ์ B6650, 16658 B2904, B3928, 16669 B8931)
- กระจายสารละลายสต็อก µL รับสารตั้งต้นที่มีโครเมียม 40 ไมโครลิตรหรือปริมาณที่เหมาะสมและสารละลาย IPTG 10 ไมโครลิตรบนแผ่นเหล็กชุบแข็งปอนด์โดยใช้เครื่องกระจายแบบปลอดเชื้อ ( ไม่ µL เป็นต้องเติม IPTG เมื่อใช้หมายเลขผลิตภัณฑ์ B392 8 เนื่องจากมี IPTG) อยู่แล้ว
- แผ่นควรมียาปฏิชีวนะที่เหมาะสมและไม่มียาปฏิชีวนะเป็นตัวควบคุม
- ปล่อยให้เพลทแห้งในช่องการไหลแบบ Laminar โดยเปิดฝาเล็กน้อย
- กระจาย อีโคลที่เปลี่ยนสภาพแล้ว 10-100 มล. ลงบนแผ่น µL ความร้อนด้านอาหารแข็ง LB โดยใช้เครื่องหว่านเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
- บ่มจานที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง
- อาณานิคมสีฟ้าและสีขาวปรากฏบนพื้นผิวของวุ้น เลือกเซลล์รีคอมบิแนนท์ในอาณานิคมสีขาวไปยัง Culture
โครงการวิจัยการคัดกรอง 2 (ใช้ได้กับหมายเลขผลิตภัณฑ์ S7313, S9811, C4478)
- เตรียมอาหารแข็งปอนด์โดยการชั่งน้ำหนักผงที่เหมาะสมปานกลางวุ้นและน้ำในขวดที่ปราศจากเชื้อ หรือชั่งน้ำหนัก C447 8 ในปริมาณที่เหมาะสมและเติมลงในน้ำในขวดปลอดเชื้อ
- เพิ่ม 300 มก./ ลิตรของหมายเลขผลิตภัณฑ์ S731 3 และ S9811 และ 500 มก./ ลิตรของเฟอร์ริกแอมโมเนียมซิเตรต (หมายเลขผลิตภัณฑ์ F5879) ลงในสื่อก่อนที่จะ autoclaving หลีกเลี่ยงขั้นตอนนี้หาก ใช้ C447 8
- หม้อนึ่งความดันขนาดกลางและเย็นพอที่จะสามารถจัดการกับขวดได้
- เพิ่มความเข้มข้นของยาปฏิชีวนะที่เลือกให้กับสื่อ
- เทอาหารแข็งปอนด์ประมาณ 25-30 มล. ลงในแผ่นความร้อนปลอดเชื้อและปล่อยให้ฝาปิดเปิดออกเล็กน้อย
- กระจาย อีโคลที่เปลี่ยนสภาพแล้ว 10-100 มล. ลงบนแผ่น µL ความร้อนด้านอาหารแข็ง LB โดยใช้เครื่องหว่านเมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
- บ่มจานที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง
- อาณานิคมสีฟ้าและสีขาวปรากฏบนพื้นผิวของวุ้น เลือกเซลล์รีคอมบิแนนท์ในอาณานิคมสีขาวไปยัง Culture
รูปที่ 3การเลือกสีฟ้า - ขาวของแบคทีเรียรีคอมบิแนนท์โดยใช้ X-gal
ข้อจำกัดของการคัดกรองสีฟ้า - ขาว
- เทคนิคสีน้ำเงิน - ขาวเป็นเพียงขั้นตอนการคัดกรอง ; มันไม่ได้เป็นเทคนิคการเลือก
- ยีนแลคซีในเวกเตอร์บางครั้งอาจไม่สามารถใช้งานได้และอาจไม่สามารถผลิต β -galactosidase ได้ อาณานิคมที่เกิดขึ้นจะไม่ถูกรวมใหม่แต่จะปรากฏเป็นสีขาว
- แม้ว่าลำดับเล็กๆของดีเอ็นเอต่างประเทศอาจจะแทรกลงใน MCS และเปลี่ยนกรอบการอ่านของยีน lacZ ซึ่งส่งผลให้เกิดอาณานิคมสีขาวที่เป็นบวกเท็จ
- เม็ดมีดขนาดเล็กภายในกรอบการอ่านของ lacZ อาจสร้างอาณานิคมสีฟ้าที่ไม่ชัดเจนเนื่องจาก β -galactosidase ไม่ได้ใช้งานเพียงบางส่วน