การโคลนและการแสดงออก

Protein Expression Vectors

พลาสมิดหรือเวกเตอร์การแสดงออกของโปรตีนเป็นดีเอ็นเอชิ้นกลมที่มีองค์ประกอบการทำงานมากมายสำหรับการโคลนและแสดงโปรตีนที่น่าสนใจ การเลือกเวกเตอร์การแสดงออกที่เหมาะสมจะถูกกำหนดบางส่วนโดยชนิดของโปรตีนสิ่งมีชีวิตที่จะแสดงโปรตีนและการประยุกต์ใช้เฉพาะและคำถามทางวิทยาศาสตร์ที่นักวิจัยมีจุดมุ่งหมายที่จะอยู่ ความหลากหลายของเวกเตอร์การแสดงออกที่มีอยู่ช่วยให้นักวิจัยสามารถเลือกที่โคลน, เลือกโคลน, และองค์ประกอบการแสดงออกของโปรตีนที่ดีที่สุดสำหรับการศึกษาของพวกเขา. เมื่อลำดับของยีนที่น่าสนใจและเวกเตอร์การแสดงออกถูกเลือกนักวิจัยมักใช้นิวเคลียสเพื่อตัดเวกเตอร์ที่ไซต์เฉพาะอย่างแม่นยำเพื่อให้ลำดับทางพันธุกรรมของความสนใจถูกโคลนในเฟรมและในที่สุดก็แสดงในสิ่งมีชีวิตโฮสต์ ที่สำคัญนักวิจัยมักจะใช้เซลล์ที่มีความสามารถทางเคมีและการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียเพื่อโฮสต์พลาสมาดีเอ็นเอ recombinant ที่พวกเขามีเสถียรภาพเมื่อเก็บไว้แช่แข็งที่ -70°C

How to Transfect Cells

การถ่ายเซลล์หมายถึงกระบวนการของการแนะนำดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอหรือโปรตีนในเซลล์ยูคาริโอติก ความหลากหลายของเทคโนโลยีทางกายภาพเคมีและชีวภาพที่มีอยู่ให้กับนักวิจัยที่จะประสบความสำเร็จในส่วนนี้ของกระบวนการแสดงออกของโปรตีน วิธีการทางกายภาพเช่น electroporation หรือวิธีการทางเคมีรวมทั้งแคลเซียมฟอสเฟต (CAPI), polyethylenimine (PEI) และ lipofection reagents ทั้งหมดที่นักวิจัยใช้กันทั่วไป ระบบการถ่ายโอนไวรัสรวมถึง lentiviral, oncotroviral และ adenoviral ยังมีให้กับนักวิทยาศาสตร์ อย่างไรก็ตามการใช้วิธีการจัดส่งไวรัสมักต้องมีการกักเก็บและตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อเหตุผลด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ

Protein Expression Systems

นักวิจัยใช้สิ่งมีชีวิตหลายชนิดเพื่อแสดงโปรตีนที่น่าสนใจ แบคทีเรียมักถูกนำมาใช้โดยนักวิจัยเนื่องจากพวกมันสามารถดูดซึมเวกเตอร์การแสดงออกได้อย่างมีประสิทธิภาพมีเวลาเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าและสามารถผลิตโปรตีน recombinant ในปริมาณสูงภายใต้สภาวะที่เหมาะสม อย่างไรก็ตามเนื่องจากแบคทีเรียเป็นสิ่งมีชีวิตโปรคาริโอตติกจึงไม่สามารถให้การดัดแปลงโปรตีนหลังการแปลที่โปรตีนบางชนิดต้องการได้ เซลล์ยูคาริโอติกรวมถึงสายยีสต์และเซลล์เลี้ยงลูกด้วยนมช่วยในการปรับเปลี่ยนโปรตีนหลังการแปลและยังมักใช้โดยนักวิจัย ทางเลือกของสายเซลล์ที่ดีที่สุดสำหรับการแสดงออกโปรตีน recombinant และกลยุทธ์การแสดงออกของโปรตีนขึ้นอยู่กับความต้องการใช้งานเฉพาะและคำถามที่นักวิทยาศาสตร์มีจุดมุ่งหมายที่จะแก้ไข