pGEX Vectors

โปรตีนที่ติดแท็กด้วย GST ถูกสร้างขึ้นโดยการแทรกยีนหรือชิ้นส่วนยีนลงใน MCS ของหนึ่งในเวกเตอร์ 13 pGEX การแสดงออกอยู่ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ TAC ซึ่งเกิดจากแลคโตสไอโซโพรพิล β -D-thiogalactoside (IPTG) อะนาล็อก เวกเตอร์ pGEX ทั้งหมดได้รับการออกแบบทางวิศวกรรมด้วยยีน laciq ภายใน ผลิตภัณฑ์ยีน laciq เป็นโปรตีนรีเพรสเซอร์ที่เชื่อมโยงกับภูมิภาคของผู้ประกอบการของโปรโมเตอร์ TAC ป้องกันการแสดงออกจนกว่าการเหนี่ยวนำโดย IPTG จึงรักษาการควบคุมอย่างแน่นหนามากกว่าการแสดงออกของเม็ดมีด

เวกเตอร์เก้าตัวมี MCS ที่ขยายตัวซึ่งมีไซต์จำกัดหกไซต์ MCS ที่ขยายตัวช่วยอำนวยความสะดวกในการโคลนแบบทิศทางเดียวของเม็ดมีด CDNA ที่ได้รับจากห้องสมุดที่สร้างขึ้นโดยใช้เวกเตอร์ Lambda จำนวนมากที่มีอยู่ pGEX 6 P- 1 pGEX - 6 P- 2 และ pGEX - 6 P- 3 แต่ละคนเข้ารหัสลำดับการรับรู้สำหรับการถ่มน้ำลายเฉพาะไซต์โดย PreScission Protease ระหว่างโดเมน GST และ MCS pGEX-160T-4, pGEX-4T 2 และ pGEX-160T 3 ได้มาจาก pGEX-160T และมีเว็บไซต์จดจำ thrombin 2 4 4 1 4 PGEX 5 X 1 PGEX 5 X 2 และ PGEX 5 X 3 เป็นอนุพันธ์ของ pGEX 3 X และมีไซต์การรับรู้ Factor Xa (ตารางที่ 1.1)

pGEX-100TK 2 มี MCS ที่แตกต่างจากเวกเตอร์อื่นๆ PGEX 2 TK ได้รับการออกแบบมาเพื่อให้สามารถตรวจจับโปรตีนที่แสดงออกมาได้โดยการติดฉลากผลิตภัณฑ์ที่ติดแท็กไว้ในหลอดทดลองโดยตรง เวกเตอร์นี้มีลำดับการรับรู้สำหรับหน่วยย่อยของตัวเร่งปฏิกิริยาของไคเนสโปรตีนที่ขึ้นอยู่กับค่ายที่ได้มาจากกล้ามเนื้อหัวใจ ไซต์โปรตีนไคเนสตั้งอยู่ระหว่างไซต์รับรู้ thrombin และ MCS โปรตีนที่แสดงออกมาสามารถติดฉลากได้โดยตรงโดยใช้โปรตีนไคเนสและ [ γ – 32 P]ATP และตรวจพบได้ง่ายโดยใช้เทคนิคการวัดรังสีหรือการวัดอัตโนมัติแบบมาตรฐาน PGEX 2 เป็นอนุพันธ์ของ pGEX 2 T และโปรตีนที่ติดแท็กสามารถแยกออกด้วย thrombin

โดยรวมแล้วเวกเตอร์ pGEX จะมีเฟรมการอ่านเชิงแปลทั้งสามเฟรมโดยเริ่มต้นจากไซต์ข้อจำกัดของ EcoRI (รูปที่ 1.1) PGEX 1λT, PGEX 6 P 1 PGEX 1 T 1 และ PGEX 5 X 4 โดยตรงสามารถยอมรับและแสดงแทรก cDNA แยกจากห้องสมุด λgt11

โปรดดูภาคผนวก 2 (พื้นที่ควบคุมสำหรับเวกเตอร์ pGEX)สำหรับรายการพื้นที่ควบคุมของเวกเตอร์ pGEX ลำดับดีเอ็นเอที่สมบูรณ์และข้อมูลไซต์จำกัดมีอยู่จาก GenBank ™ หมายเลขทะเบียน GenBank จะแสดงอยู่ในภาคผนวก 2 (พื้นที่ควบคุมสำหรับเวกเตอร์ pGEX)

รูปที่ 1.1 แผนที่ของเวกเตอร์ GST แสดงเฟรมการอ่านและคุณสมบัติหลัก เวกเตอร์ทั้ง 13 ตัวมีการหยุดการเข้ารหัสในเฟรมการอ่านทั้งสามเฟรมที่ดาวน์สตรีมจาก MCS (ไม่แสดงในแผนที่นี้) ดูภาคผนวก 2 (พื้นที่ควบคุมสำหรับเวกเตอร์ pGEX)สำหรับพื้นที่ควบคุมของเวกเตอร์ 13 ตัว

เลือกเวกเตอร์ที่เหมาะสมเพื่อให้ตรงกับกรอบการอ่านของเม็ดมีดที่โคลนไว้

พิจารณาว่าโปรตีเอสและเงื่อนไขใดสำหรับการถ่มน้ำลายเหมาะที่สุดสำหรับการเตรียมโปรตีนเป้าหมายของคุณ

pGEX-160P 6 PreScission Protease เวกเตอร์นำเสนอวิธีการที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดสำหรับการถ่มน้ำลายและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนที่ติดแท็กด้วย GST การถ่มน้ำลายเฉพาะไซต์จะดำเนินการพร้อมกับการตรึงโปรตีเอสพร้อมกันในคอลัมน์ โปรตีเอสมีกิจกรรมสูงที่อุณหภูมิต่ำเพื่อให้ทุกขั้นตอนสามารถดำเนินการในห้องเย็นเพื่อปกป้องความสมบูรณ์ของโปรตีนเป้าหมาย ลบเอนไซม์และแท็ก GST ออกในขั้นตอนเดียว