ข้ามไปยังเนื้อหา

โคโลนี PCR

อาณานิคม PCR เป็นวิธีที่ง่ายและรวดเร็วในการตรวจสอบการประกอบที่ถูกต้องของโครงสร้าง DNA โคลน ตามเนื้อผ้าการตรวจสอบการแทรกดีเอ็นเอในระหว่างการโคลนนั้นใช้เวลานานหลังจากการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียด้วยการทำให้ดีเอ็นเอที่ลำบากและการย่อยเอนไซม์ที่อุดตันตามมา Colony PCR เป็น วิธีการ PCR โดยตรงที่ข้ามทั้งการแยกดีเอ็นเอและการย่อยข้อจำกัดให้โซลูชันที่รวดเร็วง่ายและราคาไม่แพงสำหรับการคัดกรองโครงสร้างที่โคลน แอปพลิเคชัน PCR อาณานิคมยังสามารถใช้งานร่วมกับโคลนการคัดกรองที่สร้างขึ้นโดยวิธีการที่ไม่ขึ้นกับลำดับและการจำกัด

สารสกัดสีแดง-N-Amp™ PCR ReadyMix ™และ Jump Start ™ RedTaq® PCR ReadyMix™ สำหรับ แอปพลิเคชัน Colony PCR

เหมาะสำหรับใช้ในการใช้งาน PCR อาณานิคม, REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™ (Cat. ไม่ R4775)และ JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™ (Cat. ไม่ P0982)ทั้งสองให้บัฟเฟอร์โพลิเมอร์ dNTP และความคงตัวเป็นโซลูชัน 2 เท่าเดียว โดยจะมีสูตรเพื่อให้ PCR โดยตรงตามด้วยการใส่ตัวอย่างลงในเจล agarose หลังจาก PCR โดยไม่จำเป็นต้องใส่บัฟเฟอร์เพิ่มเติมหรือใส่สีย้อม สีย้อมเฉื่อยจะย้ายในอัตราเดียวกับส่วนฐานคู่ 125 ให้การยืนยันภาพของการย้ายดีเอ็นเอ

คุณสมบัติและประโยชน์

  • การทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอก่อนการขยายไม่จำเป็น เหมาะสำหรับใช้กับสายพันธุ์ทั่วไปของ E. coliเช่น SIG10 5 a, NovaBlue (K-3), 12 BL21 (DE3) และสายพันธุ์ DH5α เช่นเดียวกับ ยีสต์ S. pombe นอกจากนี้ยังสามารถขยายตัวอย่างใหม่ได้เช่นใน PCR ที่ซ้อนกัน
  • ความจำเพาะและผลผลิตสูง: JumpStart ™  Taq DNA polymerase ซึ่งเป็นแอนติบอดีที่ไม่ได้รับการกระตุ้นด้วยเอนไซม์ร้อนถูกออกแบบมาเพื่อลดการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงในขณะที่เพิ่มผลผลิตและความจำเพาะของเป้าหมาย JumpStart™ Taq ขยายเป้าหมายได้ถึง 7 kb ยาว
  • ความสะดวกสบาย: คุณสมบัติการเริ่มต้นร้อนใน  ผลิตภัณฑ์ JumpStart ™ช่วยให้การตั้งค่าปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องซึ่งจะเป็นประโยชน์เมื่อทำงานกับตัวอย่างหลาย REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™และ JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™มีความเสถียรที่ 4°C หรือ 20°C
  • JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™แสดงให้เห็นว่าสามารถทนต่อความเข้มข้นของ LB ได้ถึง 20% และ LB Agar หรือ Broth ที่ยอดเยี่ยมได้ถึง 10%
  • ความสามารถในการทำซ้ำ: ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนจากขั้นตอนปิเปตหลายขั้นตอนและให้ประสิทธิภาพที่สอดคล้องกันในหลายปฏิกิริยา
  • เจลพร้อมใช้: ไม่จำเป็นต้องเพิ่มบัฟเฟอร์การโหลดหรือสีย้อมการติดตาม ผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกบรรจุลงในเจลอาการอสโดยตรงหลังจากการขยาย tracer สีแดงจะย้ายที่อัตราประมาณเท่ากับชิ้นส่วน 125 bp (เร็วกว่าสีน้ำเงิน bromophenol) เล็กน้อย

โคโลนี PCR Protocol

โปรโตคอล PCR อาณานิคมนั้นตรงไปตรงมา: เพียงแค่เพิ่มอาณานิคมจำนวนเล็กน้อยจากแผ่นหรือการเพาะเชื้อแบคทีเรียที่หนาแน่นไปยังส่วนผสมหลักของ PCR และไปยังเทอร์โมไซเคิล การสลายของเซลล์เกิดขึ้นในระหว่างการบ่มที่อุณหภูมิสูงครั้งแรก ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้จะสามารถวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสหรือวิธีการตรวจจับดีเอ็นเออื่นๆได้ วิธีการประหยัดเวลานี้เหมาะสำหรับการคัดกรองเพียงไม่กี่อาณานิคมหรือสำหรับการคัดกรองปริมาณงานสูงของโคลนจำนวนมาก

1. เตรียม PCR master mix (สเกลตามจำนวนตัวอย่างที่จะวิเคราะห์):

2. µL ส่วนผสมหลักของ PCR (ขนาด 20 มม.) ลงในหลอด PCR หรือแผ่นแต่ละหลอด
3. ใช้ปิเปตต์ขนาดเล็กที่ผ่านการฆ่าเชื้อหรือเซลล์ถ่ายโอนไม้จิ้มฟันที่ผ่านการฆ่าเชื้อจากแต่ละอาณานิคมไปยังหลอด PCR และคนให้เข้ากันเป็นเวลาสั้นๆเพื่อผสมใหม่ใน PCR master mix ส่วนผสมอาจดูมีเมฆเล็กน้อย หมายเหตุ: อย่าเลือกเซลล์มากเกินไป การโหลดเซลล์มากเกินไปจะรบกวน PCR
4. ขยายดีเอ็นเอเป้าหมายด้วยเงื่อนไขเทอร์โมไซเคิลต่อไปนี้:

ขั้นตอนการสลายเซลล์มีความยาวมากกว่าการสลายตัวเริ่มต้นทั่วไปเพื่อทำลายผนังแบคทีเรียได้อย่างมีประสิทธิภาพ

5      หลังจาก µl PCR ให้โหลด 5 ถึง 10 μ m ของแต่ละปฏิกิริยาลงในเจล agarose 1 เปอร์เซ็นต์โดยตรงช่วยให้เลนสำหรับบันไดที่เหมาะสมและทำอิเล็กโตรโฟเรซิส

การใช้งาน PCR อาณานิคม กับ แบคทีเรีย และ ยีสต์

โคโลนี PCR ดำเนินการโดยใช้แบคทีเรียและสายพันธุ์ยีสต์ที่เป็นตัวแทน E. coli เซลล์ที่มีอำนาจ SIG10 5 a (หมายเลขแมว CMC0001), NovaBlue (Cat. 69825 หมายเลข), BL21 (DE3) (Cat. 69450 หมายเลข), และ DH5α (Thermo Fisher Scientifical) ถูกแปลงด้วย pET28a(+) ที่มีลำดับแทรก SIG10 5 กะก็ถูกแปลงด้วยเวกเตอร์ pET28a (+) ที่ว่างเปล่า อาณานิคม E. coli ถูกคัดกรองสำหรับเม็ดมีดโดยใช้ REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™และไพรเมอร์ flanking ที่ขยายเม็ดมีด 1 kbp สายพันธุ์ทั้งหมดของ E. coli เข้ากันได้กับ PCR อาณานิคมผลิตแอมพลิฟายเออร์เป้าหมายโดยตรงจากอินพุตเซลล์น้ำมันดิบโดยไม่ต้องขั้นตอนการสกัดดีเอ็นเอ (รูปที่ 1)

PCR อาณานิคมของเม็ดมีด 1 kbp จาก <i></i> อาณานิคม E. coli ได้รับการดำเนินการโดยใช้ REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™

รูปที่ 1เจล Agarose ของ ผลิตภัณฑ์ PCR อาณานิคม E. coli ทำการตรวจโคโลนี PCR ของเม็ดมีด 1 kbp โดยใช้ REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™และวิเคราะห์บนเจล agarose 1% ผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบจากเซลล์ที่แปลงแล้วทั้งหมดที่มี pET28a (+) ที่มีเม็ดมีด (ตัวอย่าง 3 - 10) ในขณะที่ไม่มีผลิตภัณฑ์ถูกขยายจากเซลล์ที่แปลงด้วยเวกเตอร์ที่ว่างเปล่า pET28a (+) (ตัวอย่าง 1 - 2)

ยีสต์ชิโซแซคคาโรมีเซสปอมบีถูกเปลี่ยนเป็นพีเอสพี 1 PCR ได้รับการดำเนินการในอาณานิคมที่เกิดขึ้นและการควบคุมพลาสมิด อาณานิคมของยีสต์ถูกคัดกรองสำหรับเม็ดมีดโดยใช้ JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™และไพรเมอร์ flanking ที่ขยายเม็ดมีด 226 bp  เช่น E. coliลำดับเป้าหมายถูกขยายจากตัวอย่างยีสต์โดยไม่มีการทำให้บริสุทธิ์ดีเอ็นเอ (รูปที่ 2)

ทำการตรวจโคโลนี PCR ของเม็ดมีด 1 kbp โดยใช้ REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™และวิเคราะห์บนเจล agarose 1% ผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบจากเซลล์ที่แปลงแล้วทั้งหมดที่มี pET28a (+) ที่มีเม็ดมีด (ตัวอย่าง 3 - 10) ในขณะที่ไม่มีผลิตภัณฑ์ถูกขยายจากเซลล์ที่แปลงด้วยเวกเตอร์ที่ว่างเปล่า pET28a (+) (ตัวอย่าง 1 - 2)

รูปที่ 2เจล Agarose ของ ผลิตภัณฑ์ PCR อาณานิคมของ S. pombe ทำการตรวจโคโลนี PCR ของเม็ดมีด 226 bp โดยใช้ JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™และวิเคราะห์บนเจล agarose 1% ผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบจากเซลล์ที่ถูกแปลงทั้งหมด (โคโลนี 1 3 และพลาสมิดเทมเพลต (การควบคุม)

ผล ของ สื่อการเจริญเติบโต ใน อัตราผลตอบแทน PCR โดยใช้ JumpStart™ RedTaq® PCR ReadyMix ™ Reagents

ในการหาปริมาณผลกระทบจากการปนเปื้อนของสื่อการเจริญเติบโตบน PCR, E. coli media lb ทั่วไป, lb Agar และ Terrific Broth (TB) จะถูกเติมลงใน น้ำยา JumpStart ™ REDTaq ® PCR ReadyMix ™ การขยายถูก α เนินการโดยใช้ pBR322 เป็นเทมเพลตไพรเมอร์ที่เหมาะสม, dCTP 32 [P] และระดับที่แตกต่างกัน (0 - 50%) ของปอนด์, ปอนด์ Agar และ TB อัตราผลตอบแทน PCR ถูกกำหนดหลังจากการตกตะกอนกรดไตรคลอโรซีติกบนตัวกรองแก้วตามด้วยการนับการตกตะกอน อัตราผลตอบแทนได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานสำหรับสื่อที่เพิ่มขึ้น 0 เปอร์เซ็นต์ มีการแสดงความรู้สึกเป็นสามเท่า การเพิ่มสื่อทั้งหมดส่งผลกระทบต่อผลผลิตของผลิตภัณฑ์แต่ PCR ที่ใช้ JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™ยังคงมีประสิทธิภาพโดยมีส่วนผสมของปฏิกิริยาที่ประกอบด้วยปอนด์และ 10 ส่วนผสมของปฏิกิริยาที่ประกอบด้วย TB หรือ LB (รูปที่ 3) ถึง 20 เปอร์เซ็นต์ ระดับเหล่านี้เกินกว่าสิ่งที่จะปนเปื้อนใน PCR อาณานิคมทั่วไปและแสดงให้เห็นถึงความทนทานต่อ สารยับยั้งที่สูงของน้ำยา JumpStart ™ REDTaq ® PCR ReadyMix ™

ผลของสื่อการเจริญเติบโตต่อผลผลิต PCR โดยใช้<sup>&reg;</sup> ตัวทำปฏิกิริยา JumpStart ™ REDTaq PCR ReadyMix ™

รูปที่ 3ผลของการเติม Spiking LB, LB Agar และ TB ลงในตัวทำปฏิกิริยา PCR ReadyMix ™ LB, สี่เหลี่ยมสีชมพู ; ปอนด์ agar, เพชรสีฟ้า ; TB, สามเหลี่ยมสีเขียว

ผลการปฏิบัติงาน PCR แบบ Colony ด้วย JumpStartTM และ ตัวทำปฏิกิริยา Taq ® Ready Mix ™สีแดง

REDExtract-N-Amp ™ PCR ReadyMix ™, JumpStart ™ REDTaq® PCR ReadyMix ™, และ ผลิตภัณฑ์ JumpStart ™และ REDTaq ® ReadyMix ™อื่นๆเช่น R2523 และ P1107 เป็นส่วนผสมหลักที่มีประสิทธิภาพซึ่งช่วยให้ PCR ของอาณานิคมและวัฒนธรรมโดยตรงจากสายพันธุ์โคลนและการแสดงออกทั่วไปรวมถึง E. coli และ S. pombeช่วยอำนวยความสะดวกในการคัดกรองโครงสร้างที่โคลนอย่างรวดเร็ว มีความทนทานสูงต่อสารยับยั้ง PCR ร่วมกันรวมถึงความเข้มข้นของ LB สูงสุด 20% และ LB Agar หรือ Terrific Broth สูงสุด 10% ส่งผลให้มีประสิทธิภาพสูงใน PCR อาณานิคม ส่วนผสมหลักสามารถเอาชนะผลกระทบของเศษเซลล์และสามารถนำมาใช้โดยตรงกับอาณานิคมน้ำมันดิบหรือสารแขวนลอยสำหรับการขยายของเป้าหมายที่มีความยาวไม่เกิน 7 กิโลไบต์ นอกจากนี้ยังมีมิกซ์ PCR Master เพิ่มเติมที่มีความเร็วสูงรวมถึงมิกซ์ KOD One ™ PCR Master ของเราและเหมาะสำหรับการใช้งาน PCR แบบอาณานิคม สำหรับ ตัวทำปฏิกิริยา PCR และทรัพยากรเพิ่มเติมให้สำรวจ PCR Reagents และ Kits Resource Hub ของเรา

วัสดุ

Loading