標準 PCR 操作流程

如何進行 PCR

標準的聚合酶鏈式反應（PCR）實驗流程包含四個步驟：

1. 將所需試劑或預混液與模板加入 PCR 管中。
2. 混合並離心。
   *若使用無加熱蓋的熱循環儀，請加入礦物油以防止蒸發。
3. 根據熱循環儀及引物的參數進行擴增。
4. 透過瓊脂糖凝膠電泳，並經溴化乙錠染色，評估擴增後的 DNA。

以下將更詳細地說明這些步驟，並提供材料與試劑選擇的建議。這是一套使用 Taq DNA 聚合酶的基本 PCR 操作流程。

PCR 步驟與必備組件

PCR 反應的故障排除涉及許多因素。觀看這段動畫，了解如何根據您的需求選擇合適的組件與循環條件，以幫助您獲得最佳結果。

如需其他聚合酶或進階 PCR 技術的相關操作流程，請參閱我們的《PCR 技術指南》中的「操作流程」章節。

請參閱我們的「PCR 基礎知識」頁面，進一步了解標準 PCR，包括其定義等相關內容。

試劑：進行 PCR 需要哪些材料？

什麼是 Taq 聚合酶？

Taq DNA 聚合酶是一種源自嗜熱細菌 Thermus aquaticus 的耐熱酶，常被用於 PCR 中的 DNA 片段擴增。此酶為重組形式，由大腸桿菌（E. coli）表達。它能夠承受反覆加熱至 95 °C（此為 PCR 技術所需），且不會造成顯著的活性損失。 經 SDS-PAGE 分析，該酶的分子量約為 94 kDa，且未檢測到內切酶或外切酶活性。它具有 5'→3' DNA 聚合酶活性及 5'→3' 外切酶活性。 每批 Taq DNA 聚合酶均經過 PCR 擴增及雙鏈定序測試。該酶以 5 單位/µL 的濃度供應，並附有經優化的 10x 反應緩衝液。

標準 Taq DNA 聚合酶

請參閱下表，根據您的反應條件選擇合適的 Taq DNA 聚合酶混合配方。可從透明或紅色染色配方中選擇，這些配方有含氯化鎂（MgCl₂）與不含氯化鎂的版本，亦可選擇已預先調配的預混液或主混合液，其中已包含緩衝液和 dNTP。

單位定義：一個單位指在 74 °C 下，30 分鐘內將總計 10 nmol 的脫氧核苷三磷酸整合至可酸沉澱的 DNA 中。

操作步驟：PCR 步驟

Taq DNA 聚合酶、模板 DNA、引物及 MgCl₂ 的濃度最佳條件，將取決於所使用的系統。可能需要針對每個單一組分分別確定最佳條件。這點對於 Taq DNA 聚合酶、循環參數及 MgCl₂ 濃度而言尤為重要。建議透過滴定法調整酶和 MgCl₂ 的濃度，以確定最佳效率。

1. 請依照表格所列順序，將試劑加入適當尺寸的試管中。（請根據反應設置選擇適當的表格：標準試劑或預混試劑。）若需進行大量反應，應先配製不含模板的主混合液，並分裝至反應管中。最後，再將模板加入相應的試管中。
   

標準 PCR 反應

*同時購買緩衝液與 Taq 聚合酶：D1806、D4309 或 D4545

即用型 PCR 反應混合液

2. 使用渦旋混合器輕柔混合，並進行短暫離心，使所有成分沉澱至試管底部。

注意：若使用無加熱蓋的熱循環儀，請在每個試管頂部加入 50 µL 礦物油，以防止蒸發。

3. 進行擴增。擴增參數會因所使用的引物及熱循環儀而異。可能需要針對個別引物、模板及熱循環儀來優化系統。

典型循環參數

建議進行 25-30 個擴增循環。

4. 可透過瓊脂糖凝膠電泳及隨後的溴化乙醯苯染色，對擴增後的 DNA 進行檢測。

      註：可透過單次氯仿萃取（1:1）去除礦物油上層，並回收水相。

核酸電泳試劑

• 瓊脂糖（預製凝膠、粉末等）
• 緩衝液，例如 MOPS-EDTA-乙酸鈉、Tris-乙酸-EDTA (TAE) 或 Tris-硼酸-EDTA (TBE)
• RNA用凝膠加樣溶液及樣本加樣緩衝液
• 電泳染色劑或染料，例如溴化乙錳

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