Phân tích dữ liệu PCR/qPCR
- Phân tích định tính PCR/qPCR
- Phân tích dữ liệu qPCR
- Lấy được các giá trị CQ chính xác
- Đặt Ngưỡng
- QPCR Định lượng chiến lược
- Định lượng đường cong tiêu chuẩn
- Định lượng tương đối/so sánh
- Chuẩn hóa
- Lựa chọn gen tham khảo
- Phân tích độ ổn định Gene tham chiếu
- Phương pháp chuẩn hóa thay thế
- Phân tích thống kê và Trực quan hóa dữ liệu
- Kỹ thuật trực quan hóa cho Phân tích Đơn biến
- Statistical Tests
- Phân nhóm theo thứ bậc
- Phân tích thành phần chính
Phân tích dữ liệu định tính PCR/qPCR
Sau khi PCR truyền thống đã được hoàn thành, dữ liệu được phân tích theo độ phân giải thông qua gel agarose hoặc gần đây hơn, thông qua hệ thống điện di mao mạch. Đối với một số ứng dụng, qPCR sẽ được chạy với dữ liệu điểm cuối được sử dụng để phân tích, chẳng hạn như để tạo kiểu SNP. Trong mỗi trường hợp, dữ liệu điểm cuối cung cấp một phân tích định tính sau khi PCR đã đạt đến giai đoạn cao nguyên. Trong một số trường hợp, có thể phân tích dữ liệu điểm cuối để thực hiện phân tích bán định lượng về năng suất PCR, nhưng các phép đo định lượng thường được thực hiện bằng cách sử dụng qPCR và phân tích các giá trị chu kỳ định lượng (CQ ) 1values.
Phân tích dữ liệu qPCR
Trong suốt hướng dẫn này, các yếu tố góp phần vào sự thay đổi trong việc đo axit nucleic sử dụng PCR hoặc qPCR đã được nhấn mạnh. Mỗi yếu tố này phải được tối ưu hóa để tạo ra một xét nghiệm cung cấp giá trị gần nhất có thể cho số lượng gen thực tế (đích) trong phản ứng. Kết quả của các quá trình này là việc tạo ra một tập hợp các giá trị CQ cho mỗi mục tiêu trong mỗi mẫu. Quá trình lấy và phân tích các giá trị CQ đó để cung cấp dữ liệu đáng tin cậy đại diện cho câu chuyện sinh học được trình bày trong chương này.
Lấy được các giá trị CQ chính xác
Chỉnh sửa đường cơ sở
Một giá trị CQ được xác định cho mỗi mục tiêu trong mỗi mẫu. Các gói phân tích khác nhau được liên kết với các công cụ khác nhau, có các cách tiếp cận thay thế để xác định CQ (và cũng sử dụng các tên thay thế, ví dụ, CT , cp , take point ). Nó nằm ngoài phạm vi của hướng dẫn này để tìm hiểu các chi tiết tinh tế của tất cả các thuật toán này. Tuy nhiên, các phép đo qPCR dựa trên các đường cong khuếch đại nhạy cảm với huỳnh quang nền. Huỳnh quang nền có thể được gây ra bởi một loạt các yếu tố, bao gồm lựa chọn đồ dẻo, huỳnh quang đầu dò còn lại không được làm nguội, rò rỉ ánh sáng vào giếng mẫu và sự khác biệt trong việc phát hiện quang học cho một tấm vi mô nhất định. Trong các xét nghiệm được thiết kế tốt, nền thấp khi so sánh với tín hiệu khuếch đại. Tuy nhiên, sự thay đổi trong tín hiệu nền có thể cản trở so sánh định lượng của các mẫu khác nhau. Do đó, điều quan trọng là phải sửa các biến đổi huỳnh quang nền gây ra sự khác biệt trong đường cơ sở (Hình 10,1).
Hình 10,1Các thành phần của biểu đồ khuếch đại. Đồ thị này cho biết sự gia tăng độ huỳnh quang với số chu kỳ cho các mẫu khác nhau. Ngưỡng được đặt trên giới hạn phát hiện nhưng thấp hơn pha cao nguyên trong đó tốc độ khuếch đại chậm lại.
Một cách tiếp cận phổ biến là sử dụng cường độ huỳnh quang trong các chu kỳ đầu, chẳng hạn như giữa các chu kỳ 5 to15, để xác định một thành phần liên tục và tuyến tính của huỳnh quang nền. Điều này sau đó được định nghĩa là nền hoặc đường cơ sở cho biểu đồ khuếch đại. Do các hiệu ứng thoáng qua, nên tránh một vài chu kỳ đầu tiên (ví dụ, chu kỳ 1 đến 5) để định nghĩa đường cơ sở vì những điều này thường cho thấy các xảo ảnh ổn định phản ứng. Càng nhiều chu kỳ được sử dụng để hiệu chỉnh đường cơ sở, độ chính xác tiềm năng của thành phần tuyến tính của các biến thể đường cơ sở càng cao. Nhiều gói phần mềm công cụ cho phép thiết lập thủ công các chu kỳ được xem xét cho định nghĩa cơ sở. Những chức năng này nên được người dùng khám phá và cám dỗ để chấp nhận cài đặt mặc định chống lại mạnh mẽ.
Một ví dụ về hiệu ứng của cài đặt đường cơ sở được hiển thị trong Hình 10,1. Như có thể thấy, các giá trị CQ và hình dạng biểu kiến của biểu đồ khuếch đại bị ảnh hưởng bởi cài đặt đường cơ sở chính xác. Trong ví dụ này, đường cơ sở cho đường cong có nhãn C3 đã được điều chỉnh không chính xác theo cách thủ công sao cho chu kỳ đường cơ sở được tính từ dữ liệu trong chu kỳ 5 đến chu kỳ 31. Điều này làm cho đường cong sụt áp thổi mức đường cơ sở không (Hình 10,2A) với CQ là 28,80. Để sửa điều này, dữ liệu thô, R, được xem và chu kỳ cuối cùng của nền tuyến tính (chu kỳ cuối cùng trước khi khuếch đại) được xác định. Trong Hình 10,2B, điều này có thể được xem là Chu kỳ 22. Đường cơ sở được thiết lập chính xác là 0 giữa chu kỳ 5 và chu kỳ 22 (hình 10,2C), và biểu đồ khuếch đại sau đó được hiệu chỉnh (Hình 10,2D). CQ được hiệu chỉnh là 26,12. Do đó, lưu ý rằng có sự khác biệt đáng kể giữa các giá trị CQ với thiết đặt đường cơ sở chính xác và không chính xác, chứng minh rằng thiết lập đường cơ sở chính xác là một thành phần quan trọng của phân tích dữ liệu.
Hình 10,2A–B. A)Ví dụ điển hình về dữ liệu giảm xuống dưới chỉ số huỳnh quang chuẩn hóa không khi cài đặt đường cơ sở không chính xác (biểu đồ khuếch đại màu xanh dương). B) Dữ liệu thô của cùng một biểu đồ khuếch đại cho thấy giới hạn của đường cơ sở tuyến tính và dữ liệu không có lỗi.
Hình 10,2C–D. C)Các giới hạn bắt đầu và kết thúc của đường cơ sở được xác định bằng cách sử dụng các cài đặt phần mềm thích hợp. D) Ứng dụng cài đặt đường cơ sở đã sửa sẽ mang lại dữ liệu chất lượng tốt
Đặt Ngưỡng
Mặc dù một số nhà nghiên cứu ủng hộ lập bản đồ âm mưu khuếch đại riêng lẻ để ước tính hiệu quả khuếch đại và số lượng mục tiêu trong các mẫu đo được2,3,4, phương pháp ban đầu và phổ biến nhất để lấy CQ là sử dụng một ngưỡng. Việc áp dụng rộng rãi phương pháp này có thể là do phương pháp ngưỡng là một phương pháp định lượng đơn giản và hiệu quả.
Nguyên lý đằng sau phương pháp ngưỡng là; để hình dung tín hiệu huỳnh quang liên quan từ khuếch đại qPCR, tín hiệu phải tăng để nó vượt quá giới hạn phát hiện của thiết bị (và do đó, đường cơ sở; Hình 10,1). Số chu kỳ cần thiết để điều này xảy ra tỷ lệ với số bản sao bắt đầu ban đầu của mục tiêu trong mẫu. Do đó, cần nhiều chu kỳ hơn để tín hiệu tăng trên đường cơ sở nếu số bản sao ban đầu thấp và ít chu kỳ hơn nếu số bản sao cao. Vì đường cơ sở được đặt ở giới hạn phát hiện cho hệ thống, các phép đo tại đường cơ sở sẽ rất không chính xác. Do đó, thay vì đo cường độ huỳnh quang tối thiểu mà hệ thống có thể phát hiện, một huỳnh quang cao hơn được chọn và một ngưỡng nhân tạo được đưa ra.
Việc lựa chọn cường độ ngưỡng yêu cầu tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản. Điều quan trọng là ngưỡng được đặt ở cường độ cố định cho một mục tiêu nhất định và cho tất cả các mẫu cần được so sánh. Nếu có quá nhiều mẫu để vừa trên một tấm đơn, thì phải áp dụng sơ đồ hiệu chỉnh giữa các tấm, ví dụ: Bao gồm một điều khiển được sao chép đóng vai trò như một điều khiển liên tấm hoặc pha loãng nối tiếp đường cong tiêu chuẩn. Về lý thuyết, ngưỡng có thể được đặt ở bất cứ đâu trên pha log-linear của đường cong khuếch đại. Tuy nhiên, trong thực tế, pha tuyến tính log của khuếch đại có thể bị xáo trộn bởi quá trình trôi đường cơ sở huỳnh quang nền, pha cao nguyên hoặc sự khác biệt về hiệu quả xét nghiệm và do đó khuếch đại gradient biểu đồ ở các chu kỳ cao hơn. Khuyến nghị đặt ngưỡng như sau:
- Đủ phía trên đường cơ sở huỳnh quang nền để tự tin tránh ma trận khuếch đại vượt qua ngưỡng sớm do huỳnh quang nền.
- Trong giai đoạn log của biểu đồ khuếch đại, nơi nó không bị ảnh hưởng bởi pha cao nguyên (điều này dễ dàng nhìn thấy nhất bằng cách xem các biểu đồ khuếch đại trên dạng xem log, Hình 10,3A).
- Tại vị trí mà các pha log của tất cả các biểu đồ khuếch đại song song.
Quá trình thiết lập ngưỡng được thể hiện trong Hình 10,3. Trong hình 10,3A, các biểu đồ khuếch đại được xem trên thang log trục Y, do đó cung cấp sự mở rộng trực quan của pha log của khuếch đại và trình bày đây là một phần tuyến tính của biểu đồ khuếch đại. Ngưỡng được thiết lập ở cường độ huỳnh quang cao nhất (tham khảo trục Y) nằm trong pha log này và trong đó tất cả các biểu đồ khuếch đại song song. Thang đo sau đó được trả về dạng xem tuyến tính (Hình 10,3B) cho thấy cài đặt cao nhất đáp ứng các yêu cầu cài đặt ngưỡng. Ngoài ra, ngưỡng có thể được thiết lập ở đầu dưới của pha log này (hình 10,3 Cand 10,3D). Miễn là pha log của các biểu đồ khuếch đại song song, ΔCQ giữa các mẫu không bị ảnh hưởng bởi thiết lập ngưỡng.
Hình 10,3Cài đặt ngưỡng ảnh hưởng đến CQ tuyệt đối được ghi lại và có thể ảnh hưởng đến ΔCq giữa các mẫu. A). Sử dụng biểu đồ log so với biểu đồ tuyến tính của dữ liệu, ngưỡng được đặt ở cường độ huỳnh quang cao nhất nhưng trong đó các biểu đồ khuếch đại hiển thị các pha log song song. B). Thiết lập ngưỡng được duy trì từ A) và được hiển thị trên biểu đồ tuyến tính so với tuyến tính. C). Sử dụng biểu đồ log so với biểu đồ tuyến tính của dữ liệu, ngưỡng được đặt ở cường độ huỳnh quang thấp nhất nhưng trong đó các biểu đồ khuếch đại hiển thị các pha log song song. D). Thiết lập ngưỡng được duy trì từ C) và được hiển thị trên biểu đồ tuyến tính so với tuyến tính. Trong mỗi trường hợp, giá trị ΔCq giữa các mẫu giống nhau.
Yêu cầu thiết lập ngưỡng tại vị trí mà các pha log-linear của các biểu đồ khuếch đại song song trở nên thích hợp hơn khi dữ liệu ở các chu kỳ cao hơn được đưa vào trong phân tích. Quy trình thiết lập ngưỡng được mô tả cho dữ liệu trong Hình 10. 3was lặp lại trên một tập dữ liệu CQ cao hơn và kết quả được trình bày trong Hình 10,4. Kết quả dữ liệu CQ trong Bảng 10. 1serve Để minh họa sự thay đổi trong CQ, và quan trọng hơn, các giá trị Δ CQ cho ba biểu đồ khuếch đại với ba thiết lập ngưỡng (Hình 10,4). Các giá trị Δ CQ và do đó ước tính số lượng tương đối của mục tiêu trong mỗi mẫu phụ thuộc nhiều vào cài đặt ngưỡng (Hình 10,4) vì các biểu đồ khuếch đại không song song.
Hình 10,4.Phân tích được thực hiện và chứng minh trong Hình 10,3 đã được lặp lại bằng cách sử dụng một tập dữ liệu khác. Trong trường hợp này, các biểu đồ khuếch đại không song song do sự khác biệt về hiệu suất của phản ứng tại CQ cao. Cài đặt thấp nhất cho A) và B) dẫn đến các giá trị ΔCq khác với các thiết lập cao nhất cho C) và D) (tóm tắt trong Bảng 10,1).
QPCR Định lượng chiến lược
Thiết lập ngưỡng và đường cơ sở chính xác là bắt buộc để định lượng đáng tin cậy. Sau khi thiết lập từng giá trị này, giá trị CQ được tạo ra và giá trị này được sử dụng làm cơ sở để định lượng. Số lượng mục tiêu trong một mẫu nhất định sau đó được xác định bằng cách sử dụng đường cong tiêu chuẩn hoặc định lượng tương đối / so sánh.
Định lượng đường cong tiêu chuẩn
Như tên gọi, định lượng đường cong tiêu chuẩn đòi hỏi phải sử dụng đường cong tiêu chuẩn để xác định số lượng các mục tiêu trong mẫu thử nghiệm. Do đó, tất cả các đại lượng được xác định cho các mẫu đều liên quan đến số lượng được gán cho đường cong tiêu chuẩn. Điều này đòi hỏi phải chạy các tiêu chuẩn bổ sung, bên ngoài cùng với mỗi bộ phản ứng mẫu. Việc lựa chọn vật liệu cho đường cong tiêu chuẩn rất quan trọng để loại bỏ sự khác biệt tiềm năng trong định lượng do sự khác biệt giữa hiệu quả xét nghiệm trong mẫu và trong tiêu chuẩn. Các vị trí gắn mồi của các tiêu chuẩn bên ngoài phải giống như các vị trí trong mục tiêu, chứa các chuỗi giống như mục tiêu, có độ phức tạp tương tự và được xử lý theo cách tương tự như có thể. Do đó, khi đo nồng độ của một mục tiêu trong cDNA, tốt nhất nên đo cùng một cDNA trong pha loãng tuần tự của mẫu kiểm soát. Tuy nhiên, đối với một số nghiên cứu có những lý do thực tế ngăn chặn điều này, vì vậy điều quan trọng là phải tái tạo các điều kiện mẫu gần nhất có thể, ví dụ, bằng cách thêm gDNA từ một loài không liên quan đến các loài thử nghiệm, vào một oligonucleotide nhân tạo hoặc plasmid tuyến tính mang trình tự tiêu chuẩn. Sau khi xác định được cấu trúc hoặc biên độ phù hợp, một đường cong tiêu chuẩn của pha loãng nối tiếp sẽ được tạo ra. CQ cho mục tiêu được xác định cho từng tiêu chuẩn và được vẽ dựa trên nồng độ hoặc hệ số pha loãng tương đối trên thang log. Điều này dẫn đến một đường cong tiêu chuẩn sau đó được sử dụng để xác định nồng độ của các mẫu xét nghiệm bằng cách so sánh các giá trị CQ lấy từ việc khuếch đại các mẫu chưa biết. Khi sử dụng đường cong tiêu chuẩn để định lượng, thiết lập ngưỡng phải được giữ nguyên không đổi để xác định CQ cho tiêu chuẩn và cho các mẫu trên cùng một tấm. Ngưỡng có thể khác nhau giữa các tấm.
Định lượng tương đối/so sánh
Định lượng tương đối hoặc so sánh sử dụng sự khác biệt trong CQ như là một định thức của sự khác biệt về nồng độ của chuỗi mục tiêu trong các mẫu khác nhau. Thay vì đo số lượng mục tiêu trên mỗi mẫu như với phương pháp đường cong tiêu chuẩn, điều này dẫn đến các tập dữ liệu hiển thị thay đổi gấp giữa các mẫu.
Ở dạng ban đầu của phương pháp này5, hiệu quả của tất cả các xét nghiệm được giả định là 100%, dẫn đến giả định rằng hiệu suất CQ là 1 (ΔCQ = 1) là kết quả của sự khác biệt gấp 2 lần trong mục tiêu. Để xác định một thay đổi gấp trong đích hoặc gen quan tâm (GOI), dữ liệu cũng phải được tham chiếu đến điều khiển tải (gen tham chiếu, tham chiếu; xem phần sau để biết thảo luận về chuẩn hóa dữ liệu).
Hình 10,5.Xây dựng đường cong tiêu chuẩn. CQ được ghi lại cho mỗi mẫu của một chuỗi pha loãng được vẽ trên thang tuyến tính log so với nồng độ tương đối.
Trong phương trình 1, tỷ lệ của GOI, sau khi điều chỉnh gen tham chiếu, trong 2 mẫu (A tương đối với B) được đo bằng: 2 (giả sử 100% các phản ứng hiệu quả) tăng lên đến sức mạnh của sự khác biệt trong các giá trị CQ cho GOI chia cho 2 tăng lên đến sức mạnh của sự khác biệt trong các giá trị CQ cho gen tham chiếu
Phương trình 1.Mô hình định lượng tương đối gốc (Livak).
Tuy nhiên, như được minh họa trong Tối ưu hóa và Xác thực xét nghiệm, hiệu quả của các phản ứng thay đổi đáng kể và điều này có thể ảnh hưởng lớn đến dữ liệu. Do đó, các giả định trong phương trình 1 đã được giải quyết (phương trình 2)6, để sự khác biệt trong hiệu quả phản ứng có thể được tích hợp vào các phân tích. Trong trường hợp này, hệ số khuếch đại 2 được thay thế bằng hiệu quả thực tế của PCR (được xác định bằng phân tích đường cong tiêu chuẩn; xem Tối ưu hóa và xác thực xét nghiệm).
Phương trình 2.Mô hình định lượng tương đối thích ứng hiệu quả (Pfaffl)
Như một ví dụ về việc sử dụngmô hình định lượng tương đối hiệu quả được điều chỉnh ( phương trình 2 ), một tập hợp các giá trị CQ được trình bày trong Bảng 10,2. Hiệu quả của GOI là 1,8 và đối với gen tham chiếu 1,94.
Đây là một ví dụ rất đơn giản về một nghiên cứu với yêu cầu đo sự khác biệt gấp giữa một gen trong hai mẫu và sau khi chuẩn hóa thành một gen tham chiếu duy nhất. Tỷ lệ cho thấy sự thay đổi gấp của GOI trong mẫu 2 so với mẫu 1, sau khi điều chỉnh gen Ref đơn. Tuy nhiên, rõ ràng là việc chọn một gen tham chiếu duy nhất, phù hợp thường là không thể và do đó, các cách tiếp cận tinh vi hơn để chuẩn hóa đã được đề xuất.
Chuẩn hóa
Mục tiêu chính của hầu hết các thí nghiệm dựa trên PCR là giải quyết câu hỏi cơ bản về việc liệu mục tiêu có hiện diện trong mẫu hay không (UNK). Ở cấp độ rất đơn giản nhất, điều này được trả lời bằng cách chạy một gel và kiểm tra các mảnh cho sự hiện diện hoặc không có của GOI mong muốn. Khi mảnh vỡ xuất hiện, việc xác nhận kích thước mảnh cho phép đảm bảo kết quả tích cực. Tuy nhiên, khi vắng mặt, có tiềm năng của một kết quả âm tính sai. Do đó, điều quan trọng là phải lặp lại xét nghiệm và cũng thực hiện ít nhất một PCR bổ sung để phục vụ như một điều khiển PCR tải và dương. Có thể sử dụng xét nghiệm kiểm soát ức chế phổ quát, SPUD (xem Lọc mẫu và Đánh giá chất lượng) để hỗ trợ sự tự tin vào kết quả tiêu cực. Một cách tiếp cận khác là chạy một xét nghiệm cụ thể cho một gen tham chiếu hoặc gen. Theo truyền thống, các xét nghiệm PCR phát hiện các gen tham chiếu, GAPDH, 18S ribosome RNA, hoặc β actin được chạy cùng với các gen cho GOI và các mảnh kết quả được hình dung trên gel. GAPDH, 18S ribosome RNA và β actin được biểu hiện cấu thành và do đó được sử dụng làm điều khiển tải trong các phân tích bán định lượng. Tuy nhiên, nó sớm trở nên rõ ràng rằng những gen này không được biểu hiện phổ biến ở cùng một nồng độ trong tất cả các tế bào, bất kể thiết kế thực nghiệm. Do đó, sự cần thiết phải có một tham chiếu ổn định khi mục tiêu là đo nồng độ axit nucleic tương đối, thường là cDNA nhưng cũng có gDNA, ví dụ, kiểm tra biến thể số bản sao của một gen.
Chuẩn hóa là quá trình hiệu chỉnh các phép đo kỹ thuật đến một tham chiếu ổn định để kiểm tra sự biến đổi sinh học thực sự. Có nhiều phương pháp để chuẩn hóa các khác biệt kỹ thuật có nghĩa là cách tiếp cận thích hợp cho thí nghiệm cụ thể phải được lựa chọn và xác thực7. Điều quan trọng là nhận ra rằng việc áp dụng các kỹ thuật bình thường hóa không phù hợp có thể gây hại cho quá trình phân tích tổng thể hơn là không bình thường hóa ở tất cả8.
Ảnh hưởng của Chất lượng Mẫu đối với Chuẩn hóa Xét nghiệm
Ảnh hưởng của tính toàn vẹn và độ tinh khiết của mẫu đối với các phép đo số lượng mục tiêu của qPCR và RT-qPCR đã được thảo luận theo chiều dài (Lọc mẫu và Đánh giá chất lượng , Kiểm soát chất lượng mẫu và Phiên âm ngược, Phiên âm ngược). Nó đã được chứng minh rằng các chất ức chế trong mẫu và thoái hóa RNA có tác dụng vi sai đối với việc đo một mục tiêu9 cho trước. Các chất ức chế ảnh hưởng đến phép đo của bất kỳ mục tiêu nào nhưng ở một mức độ khác nhau, tùy thuộc vào thiết kế xét nghiệm. Sự suy giảm tổng lượng RNA ảnh hưởng đến việc đo mRNA và miRNA 10, một lần nữa lại phụ thuộc nhiều vào thiết kế thực nghiệm tổng thể. Do đó, điều quan trọng là phải xem xét ảnh hưởng của nồng độ mẫu đối với phản ứng RT và ảnh hưởng của chất lượng mẫu đối với dữ liệu sau khi chuẩn hóa. Chuẩn hóa sẽ không chống lại tác động của các xét nghiệm chất lượng thấp hoặc các mẫu (xem Tối ưu hóa và Xác thực Xét nghiệm).
Chuẩn hóa tiếp cận
Lý tưởng nhất, các phương pháp chuẩn hóa chống lại biến đổi có thể được giới thiệu trong quá trình nhiều bước cần thiết để thực hiện phân tích qPCR (Hình 10,6). Tuy nhiên, việc áp dụng chuẩn hóa ở bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình có thể không kiểm soát được lỗi kỹ thuật và/hoặc sai lệch đã, hoặc sẽ được giới thiệu ở giai đoạn trước hoặc sau, tương ứng. Các phương pháp chuẩn hóa không loại trừ lẫn nhau và do đó việc áp dụng một kết hợp các điều khiển được khuyến nghị11.
Hình 10,6.QPCR là một quá trình đa bước và mỗi bước phải được điều khiển. Chuẩn hóa phải được xem xét trong một chuỗi các điều khiển.
Mục tiêu của chuẩn hóa là cung cấp một điểm tham chiếu ổn định mà các phép đo có thể được đề cập; do đó, sự lựa chọn của hệ số chuẩn hóa phải là một phép đo ổn định trong suốt thí nghiệm. Đây có thể là gen tham chiếu ổn định, hoặc một trong những lựa chọn thay thế, chẳng hạn như số tế bào, khối lượng mô, nồng độ RNA/DNA, tăng đột biến bên ngoài12, hoặc một thước đo đại diện của các gen biểu hiện toàn cầu.
Lựa chọn gen tham khảo
Các gen tham chiếu là các mục tiêu có số lượng không thay đổi do kết quả của thí nghiệm. Khi định lượng sự thay đổi số lượng bản sao chép DNA trong đó số lượng bản sao của chuỗi quan tâm có thể thay đổi, phép đo được đơn giản hóa bằng cách nhắm mục tiêu vào một khu vực gen thay thế mà không được biết là không thay đổi. Một ví dụ về cách điều này có thể được áp dụng là khi đo khuếch đại bộ gen 2 (HER-2)của con người 13. Sự mất ổn định gen CỦA HER-2 là một chỉ số tiên lượng trong ung thư vú và đo chính xác tình trạng khuếch đại HER-2 là quan trọng trong quản lý bệnh nhân. Tình trạng CỦA HIS-2 có thể được đo bằng qPCR bằng cách so sánh các bản sao của HER-2 với một mục tiêu bộ gen khác đang hoạt động như một sự kiểm soát.
Khi đo biểu hiện gen, các gen tham chiếu là các mục tiêu có nồng độ mRNA không thay đổi do kết quả của thí nghiệm. Một nghiên cứu ví dụ sẽ là một trong đó ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen X đang được đo sau khi bổ sung một hợp chất nguyên sinh vào một đơn lớp tế bào. Một điểm tham chiếu là cần thiết để đo sự thay đổi trong gen X. Do đó, một gen khác (hoặc gen) được biết là không bị ảnh hưởng bởi mitogen trong câu hỏi cũng được đo. Điều này cung cấp cho các nhà nghiên cứu thách thức ngay lập tức về việc tìm kiếm một mục tiêu mRNA không bị ảnh hưởng bởi các thủ tục thí nghiệm, trước khi có thể nghiên cứu GOI. Quá trình xác nhận các gen tham chiếu này là cơ bản cho phép đo chính xác GOI. Cách tiếp cận được sử dụng rộng rãi nhất để chuẩn hóa là bỏ qua quá trình này và bình thường hóa dữ liệu biểu hiện gen thành một gen tham chiếu duy nhất, không xác thực. Thực hành này không được khuyến cáo và trực tiếp phản đối với các hướng dẫn MIQE1. Việc định lượng mRNA bởi RT-qPCR thường xuyên bị tổn hại bởi sự lựa chọn không chính xác các gen tham chiếu. Không thể chấp nhận theo các thực hành tương đối phổ biến của việc sử dụng một gen tham chiếu vì mồi đã ở trong tủ đông lạnh, nó đã được sử dụng trong lịch sử trên các blot Bắc, nó được sử dụng bởi một đồng nghiệp, hoặc được sử dụng trong một phòng thí nghiệm khác cho một thí nghiệm khác. Các gen tham chiếu cần phải được xác nhận trong các kịch bản thực nghiệm cụ thể để được đảm bảo rằng gen tham chiếu được đề cập không bị ảnh hưởng bởi thí nghiệm. Nếu việc xác nhận này không được thực hiện và gen tham chiếu bị ảnh hưởng bởi thí nghiệm, kết quả có thể không chính xác và giải thích tiếp theo có khả năng dẫn đến dữ liệu vô nghĩa8.
Có một loạt các tài liệu khoa học mô tả các phương pháp khác nhau để chuẩn hóa7-1 4as cũng như một loạt các ấn phẩm mô tả các giao thức cần thiết để xác định các gen chuẩn hóa thích hợp nhất cho một kịch bản thực nghiệm nhất định. Trong quá khứ, một câu hỏi quan trọng là chọn một hay nhiều gen tham chiếu, chi phí chạy thấp hơn có nghĩa là các thực hành tốt nhất hiện nay đã chuyển sang đo nhiều gen tham chiếu.
Việc lựa chọn các gen tham chiếu ổn định đòi hỏi các nhà phân tích phải đánh giá sự ổn định của qPCR cho một số (thường là 10 đến 20 gen) của mRNA ứng cử viên nhắm mục tiêu 7on một tập hợp con các mẫu đại diện cho thử nghiệm và kiểm soát mRNA. Một giao thức đầy đủ được cung cấp trong Phụ Lục A, Giao thức, của hướng dẫn này và có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp phân tích khác nhau sử dụng các chương trình như REST15, GeNorm14, Bestkeeper16, hoặc NormFinder17. Quy trình này được mô tả chi tiết hơn trong phần sau, Phân tích độ ổn định Gene tham chiếu.
Phân tích độ ổn định Gene tham chiếu
Gen tham chiếu theo nghĩa đen là điểm pivot cho các xét nghiệm định lượng tương đối qPCR. Do đó, điều quan trọng đối với độ tin cậy của toàn bộ xét nghiệm là gen tham chiếu ổn định. Nếu biểu hiện gen tham chiếu khác nhau giữa các mẫu, sự thay đổi sẽ được chuyển trực tiếp đến kết quả định lượng và sự biến đổi bổ sung có thể che khuất hiệu ứng sinh học quan sát được mong muốn hoặc thậm chí tệ hơn, có thể tạo ra một sự xuất hiện hoàn toàn nhân tạo của một hiệu ứng sinh học, một gen không liên quan đến gen thực sự quan tâm. Vì những lý do này, khuyến cáo mạnh mẽ rằng một số biện pháp an toàn được thực hiện để làm cho sự biến đổi gen tham chiếu không đáng kể và thực hiện các biện pháp hiệu ứng sinh học càng quan trọng càng tốt.
Có thể cho rằng, biện pháp an toàn quan trọng nhất là sử dụng không chỉ một, mà hai hoặc nhiều hơn, các gen tham chiếu. Sự biểu hiện của một số gen tham chiếu có thể được tính trung bình để giảm sự biến đổi kỹ thuật do chuẩn hóa. Điều này có thể hữu ích để cải thiện ý nghĩa trong các phép đo các tác động sinh học nhỏ. Tuy nhiên, quan trọng hơn, hai hoặc nhiều gen tham chiếu cung cấp các biện pháp kiểm soát lẫn nhau để duy trì sự ổn định và kiểm soát các sự cố bất ngờ có thể ảnh hưởng đến mức biểu hiện của một trong các gen tham chiếu. Với một gen tham chiếu duy nhất, có nguy cơ ảnh hưởng bất ngờ của biểu hiện gen có thể không được phát hiện trong xét nghiệm.
Một biện pháp an toàn khác là sử dụng nhiều hơn một phương pháp xác định các gen tham chiếu ổn định. Sau đây là một ví dụ để minh họa một số khía cạnh của chuẩn hóa gen tham chiếu, bao gồm một lợi thế có thể của việc sử dụng cả phương pháp GeNorm và NormFinder trên cùng một tập dữ liệu.
Bảng 10. 3holds Một danh sách các ứng cử viên gen tham chiếu được đánh giá trong một hội thảo mà chúng tôi đã tiến hành trước đó với EMBL. Các mẫu được thu thập từ nuôi cấy tế bào người trong hai nhóm điều trị khác nhau. Tập dữ liệu này sẽ được sử dụng để chứng minh các khía cạnh của xác thực gen tham chiếu.
Cả hai thuật toán NormFinder và GeNorm đều được phát triển với giả định rằng việc kiểm tra vô số các ứng cử viên gen tham chiếu có thể được sử dụng để xếp hạng sự ổn định của các ứng cử viên gen tham chiếu riêng lẻ. Giả định này có thể đúng nếu, ví dụ, tất cả các ứng cử viên gen tham chiếu khác nhau theo phương pháp ngẫu nhiên xung quanh mức độ biểu hiện ổn định. Tuy nhiên, điều này có thể không nhất thiết là đúng trong thực tế. Để tránh các kết quả gây hiểu lầm, do đó, cần thận trọng để tránh các ứng cử viên gen tham chiếu được điều chỉnh và đặc biệt là đồng điều chỉnh.
Danh sách các ứng cử viên gen tham chiếu được hiển thị trong Bảng 10. 3was được lựa chọn đặc biệt để chọn các gen thuộc các lớp chức năng khác nhau, làm giảm khả năng các gen có thể được đồng điều hòa. Một ngoại lệ đáng chú ý là GAPDH, có mặt ở đây trong hai phiên bản. Mặc dù điều này không ảnh hưởng đến phân tích này, thực hành tốt nhất là tránh nhiều mục nhập của gen có thể bị nghi ngờ là đồng điều hòa.
Thuật toán đầu tiên được chứng minh là geNorm. Điều này cung cấp một đánh giá về độ ổn định của gen bằng cách tính toán một biện pháp ổn định gen gọi là M-Value, dựa trên các so sánh theo cặp giữa ứng cử viên gen tham chiếu được phân tích và tất cả các ứng cử viên gen tham chiếu khác trong bộ dữ liệu. Nó được thực hiện theo kiểu lặp lại, có nghĩa là trong ví dụ này, thủ tục được thực hiện lần đầu tiên trên tất cả 15 ứng cử viên gen tham chiếu, ít ổn định nhất được loại bỏ, quá trình được lặp lại trên 14 còn lại, ứng cử viên ít ổn định thứ hai được loại bỏ, và cứ thế cho đến khi hai gen tham chiếu vẫn còn.
Có thể có những lúc việc xác định gen tham chiếu ổn định nhất có thể là đặc biệt thách thức. Một trường hợp có thể xảy ra khi tất cả các ứng cử viên gen tham chiếu hoạt động kém. Một trường hợp khác có thể là nếu tất cả các ứng cử viên gen tham chiếu hoạt động tốt. Để phân biệt giữa hai trường hợp này, một hướng dẫn hữu ích là các gen tham chiếu với giá trị M dưới 0,5 có thể được coi là biểu hiện ổn định.
Thuật toán thứ hai được chứng minh là NormFinder, là một gói phân tích gen tham chiếu có sẵn miễn phí (Phụ lục B, Tài nguyên bổ sung). Thuật toán cơ bản có cách tiếp cận giống như ANOVA để tham khảo đánh giá tính ổn định của gen trong đó toàn bộ và các nhóm con được phân tích cho các biến thể. Một lợi thế của điều này là các biện pháp thu được liên quan trực tiếp đến mức độ biểu hiện gen. Độ lệch chuẩn là 0,20 trong đơn vị CQ do đó đại diện cho khoảng 15% sự thay đổi trong mức độ biểu hiện số bản sao của ứng cử viên gen tham chiếu cụ thể.
Để thuận tiện, trong minh họa này, cả hai gói phân tích này đều được truy cập bằng cách sử dụng phần mềm phân tích dữ liệu GenEx (MultiD), nhưng chúng cũng có sẵn dưới dạng các gói độc lập (Phụ lục B, Tài nguyên Bổ sung).
Sơ đồ thanh hiển thị trong Hình 10. 7illustrate gen tham chiếu được xếp hạng theo các biện pháp ổn định tương ứng của chúng bằng cách sử dụng cả hai thuật toán. Ngoài ra, một đồ thị cho thấy độ lệch chuẩn tích lũy từ NormFinder chỉ ra rằng sự kết hợp của tối đa ba gen tham chiếu tốt nhất có thể mang lại những cải thiện ổn định.
Hình 10,7.Sơ đồ thanh hiển thị các biện pháp ổn định: Giá trị m cho GeNorm và độ lệch chuẩn cho Công cụ tìm Bắc Âu. Ngoài ra, một đồ thị cho thấy độ lệch chuẩn tích lũy từ NormFinder chỉ ra rằng sự kết hợp của tối đa ba gen tham chiếu tốt nhất có thể mang lại những cải thiện ổn định. Bộ dữ liệu được tạo ra từ các xét nghiệm được thiết kế cho các ứng cử viên gen tham chiếu được hiển thị trong Bảng 10,3 và được đo trên nuôi cấy tế bào người trong hai nhóm điều trị khác nhau. Lưu ý rằng, trong trường hợp này, các thuật toán ổn định gen tham chiếu geNorm và NormFinder không đồng ý về các gen tham chiếu tốt nhất.
Hình 10,8.Hồ sơ biểu thức trung bình của các ứng cử viên gen tham chiếu của hai mẫu trong mỗi nhóm điều trị. Mẫu 1 và 2 thuộc nhóm điều trị đầu tiên và mẫu 3 và 4 thuộc nhóm điều trị thứ hai. Cấu hình biểu thức của SDHA và CANX được biểu thị bằng màu đỏ. Hồ sơ biểu thức của UBC được biểu thị bằng màu vàng. Bảng liệt kê các giá trị CQ đo được trong tập dữ liệu.
Do các cấu hình biểu hiện sai lệch, có thể SDHA và CANX được điều chỉnh bởi các lựa chọn thay thế điều trị khác nhau và do đó, không phù hợp như các gen tham chiếu. Loại bỏ chúng khỏi tập dữ liệu và lặp lại kết quả phân tích dẫn đến sự đồng thuận giữa cả hai thuật toán và lựa chọn tốt nhất của các gen tham chiếu là EIF4A2 và ATP53 (Hình 10,9). Trong tính toán NormFinder về độ lệch chuẩn tích lũy, rõ ràng là việc bổ sung thêm các gen tham chiếu không cải thiện sự ổn định.
Hình 10,9.Kiểm tra các cấu hình biểu thức và các giá trị CQ đo được (Hình 10,8) làm dấy lên lo ngại rằng SDHA và CANX có thể được đồng điều chỉnh trong xét nghiệm áp dụng. Sự đồng điều hòa có thể phá vỡ các thuật toán ổn định gen tham chiếu. Sơ đồ thanh hiển thị các biện pháp ổn định: A) Giá trị M cho geNorm và B) độ lệch chuẩn cho NormFinder. Tập dữ liệu giống với tập dữ liệu được sử dụng trong Hình 10,8 ngoại trừ dữ liệu cho SDHA và CANX đã bị xóa. Lưu ý rằng với tập dữ liệu giảm này, các thuật toán ổn định gen tham chiếu geNorm và NormFinder đồng ý về các gen tham chiếu tốt nhất.
Phân tích dữ liệu trong ví dụ này nhằm minh họa rằng việc sử dụng GeNorm và NormFinder song song cho phép xác định các ứng cử viên gen tham chiếu đồng điều chỉnh và việc loại bỏ các gen này khỏi các nghiên cứu sâu hơn cung cấp một nhận dạng cuối cùng của các gen tham chiếu có thể được thông qua với sự tự tin hơn sau khi sử dụng một phân tích duy nhất. Việc xác định và lựa chọn các gen tham chiếu ổn định dẫn đến sự an toàn hơn của phân tích dữ liệu.
Phương pháp chuẩn hóa thay thế
Trong khi chuẩn hóa để tham chiếu gen là phương pháp phổ biến nhất để chuẩn hóa xét nghiệm, có những tình huống mà cách tiếp cận này không phù hợp, chẳng hạn như khi một số lượng lớn gen trong một nhóm mẫu không đồng nhất được so sánh, hoặc khi phân tích miRNA. Trong những tình huống này, cần phải áp dụng một chiến lược thay thế.
Chuẩn hóa theo khối mô hoặc số ô
Phép đo số ô hoặc khối lượng mô được sử dụng làm yếu tố chuẩn hóa không đơn giản như lần đầu tiên nó có thể xuất hiện. Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào tương đối dễ dàng để bình thường hóa dựa trên số lượng tế bào. Tuy nhiên, việc bổ sung một phương pháp điều trị có thể ảnh hưởng đến hình thái tế bào, làm phức tạp tỷ lệ số tế bào so với tổng số RNA/gen biểu hiện khi so sánh với nuôi cấy kiểm soát. Việc điều trị thử nghiệm có thể dẫn đến việc sản xuất thêm ma trận tế bào gây ra sự khác biệt trong hiệu quả chiết xuất axit nucleic.
Các mô sinh học có thể rất không đồng nhất trong và giữa các đối tượng, với sự biến đổi rõ ràng hơn khi mô khỏe mạnh được so sánh với mô bệnh. Ngay cả các mô ít phức tạp hơn, chẳng hạn như máu, có thể khác nhau đáng kể về số lượng tế bào và thành phần sao cho biểu hiện gen thay đổi đáng kể giữa các nhà tài trợ khỏe mạnh18.
Bất kỳ sự chậm trễ nào trong các quá trình được sử dụng để tinh chế axit nucleic sẽ dẫn đến sự thay đổi trong RNA đo được. Ví dụ, sự chậm trễ trong việc xử lý các tế bào đơn nhân máu ngoại vi và chiết xuất RNA từ các tế bào, dẫn đến những thay đổi đáng kể trong biểu hiện gen19. Các phương pháp cơ bản các thủ tục khai thác cũng là nguồn chính của sự biến đổi kỹ thuật. Ngay cả quá trình cô lập được chọn để lấy mẫu các tế bào có nguồn gốc từ máu và tinh chế RNA dẫn đến sự khác biệt trong các cấu hình biểu hiện gen rõ ràng20. Do đó, việc cân nhắc chuẩn hóa đầu tiên là đảm bảo rằng việc thu thập và xử lý hoàn toàn giống nhau cho tất cả các mẫu. Sau đó, điều quan trọng là phải thực hiện kiểm soát chất lượng đầy đủ để chắc chắn về nồng độ, tính toàn vẹn và độ tinh khiết của mẫu ( Các quy trình liên quan đến Đánh giá chất lượng và tinh chế mẫu trong Phụ lục A).
Chuẩn hóa thành nồng độ RNA
Tối thiểu, ước tính nồng độ mẫu (DNA cho qPCR hoặc RNA cho RT-qPCR) là quan trọng và, như được đề cập trong Đánh giá chất lượng và tinh chế mẫu, điều quan trọng là phải đảm bảo rằng cùng một dụng cụ được sử dụng cho tất cả các phép đo vì việc xác định nồng độ axit nucleic cũng thay đổi và phụ thuộc vào kỹ thuật.
Khi đo tổng nồng độ RNA, phần lớn mẫu được cấu tạo từ rRNA, với chỉ một phần nhỏ bao gồm mRNA được quan tâm khi kiểm tra biểu hiện gen, hoặc sncRNA khi kiểm tra sự điều hòa biểu hiện gen. Điều này có nghĩa là nếu nồng độ rRNA tăng một lượng nhỏ nhưng mRNA vẫn không đổi, tổng nồng độ RNA sẽ tăng lên. Nồng độ mRNA phải tăng một lượng đáng kể để gây ra sự gia tăng rõ ràng trong tổng nồng độ RNA. Do đó, nồng độ rRNA là một thước đo không đáng tin cậy về nồng độ mRNA, nhưng đối với nhiều giao thức, cần phải có nồng độ RNA bằng nhau để đảm bảo phiên mã ngược chính xác (xem Phiên mã ngược).
Chuẩn hóa thành biểu thức Gene toàn cầu
Khi đo số lượng lớn các mục tiêu, các nhà phân tích có thể ước tính trung bình toàn cầu của tổng biểu hiện gen và xác định các trình tự RNA được điều chỉnh đi chệch khỏi trung bình này. Cách tiếp cận này thường được sử dụng để chuẩn hóa các mảng biểu hiện gen. Nó là một sự thay thế có giá trị để sử dụng các gen tham chiếu và có thể thích hợp hơn khi nhiều mục tiêu đang được đo.
Một cách tiếp cận được khám phá gần đây là phép đo các yếu tố lặp lại được biểu hiện nội sinh (ERE) có mặt trong nhiều mRNA. Nhiều loài chứa các yếu tố lặp lại này (ALU ở động vật linh trưởng, các yếu tố B ở chuột), có thể cung cấp ước tính phân số mRNA. Phép đo các chuỗi đích này đã được chứng minh là thực hiện như các hệ thống chuẩn hóa thông thường9 (Le Bert, et al., trong quá trình chuẩn bị) và có thể cung cấp một giải pháp phổ quát hoặc một giải pháp thay thế cho các thí nghiệm phức tạp nơi không có tổ hợp gen tham chiếu ổn định.
Chuẩn hóa dữ liệu miRNA
Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo về một gen tham chiếu phổ quát của mRNA. Do đó, việc lựa chọn hệ thống chuẩn hóa vẫn còn khá thực nghiệm. Khi có thể, các miRNA bất biến ổn định có thể được xác định từ các phương pháp tiếp cận rộng bộ gen, ví dụ, microarray. RNA nuclear nhỏ (snoRNA) cũng đã được sử dụng làm gen tham chiếu. Biểu hiện gen toàn cầu cũng là một phương pháp hữu ích để bình thường hóa biểu hiện miRNA khi một tham chiếu ổn định chưa được biết và hàng trăm mục tiêu đã được phân tích21,22,23. Phương pháp này thích hợp hơn cho những người sử dụng phương pháp tiếp cận dẫn đến việc bắt giữ tất cả các mRNA dưới dạng cDNA ở dạng ghép kênh, ví dụ, các hệ thống Exiqon và miQPCR (tham khảo Castoldi et al. Trong PCR Technologies, Current Innovations24).
Bản sao kỹ thuật và sinh học
The purpose of normalization is to avoid systematic errors and to reduce data variability for the eventual statistical analysis. Một khía cạnh quan trọng khác của việc thiết lập dữ liệu cho phân tích thống kê là sử dụng các bản sao dữ liệu.
Các bản sao sinh học là hoàn toàn cần thiết cho phân tích thống kê. Mức độ quan trọng thống kê thường được đặt ở mức cắt giảm quan trọng 5%. Đối với các hiệu ứng sinh học gần với mức độ quan trọng như vậy, có thể cần phải có ít nhất 20 bản sao sinh học để xác định mức độ quan trọng của xét nghiệm (1: 20 tương ứng với 5%). Trên thực tế, người ta đã gợi ý rằng ít nhất 50 lần số lượng quan sát được yêu cầu phải được ghi lại để ước tính chính xác về ý nghĩa25, tức là theo thứ tự của một nghìn mẫu sinh học. Đương nhiên, những hạn chế thực tế hiếm khi cho phép tái tạo sinh học ở những mức này. Hơn nữa, ước tính chính xác về số lượng bản sao sinh học cần thiết để đáp ứng một mức độ quan trọng nhất định cũng phụ thuộc vào mức độ biến đổi của dữ liệu. Tuy nhiên, điều quan trọng là nhận ra rằng một sai lầm phổ biến là đánh giá thấp số lượng cần thiết của các bản sao sinh học để có thể đưa ra kết luận đáng tin cậy. Chúng tôi khuyên bạn nên thực hiện một nghiên cứu thí điểm ban đầu để đánh giá độ biến thiên vốn có của xét nghiệm và kích thước tiềm năng của hiệu ứng sinh học có thể quan sát được để có cơ sở tốt để ước tính số lượng bản sao sinh học cần thiếtlà 26.
Bản sao kỹ thuật không được sử dụng trực tiếp cho phân tích thống kê. Thay vào đó, các bản sao kỹ thuật được sử dụng để sao lưu mẫu (trong trường hợp một số mẫu bị mất trong quy trình xử lý kỹ thuật) và để cải thiện đánh giá độ chính xác của dữ liệu. Các bản sao kỹ thuật có thể cải thiện độ chính xác của dữ liệu nếu giả định đúng rằng chúng thay đổi ngẫu nhiên xung quanh phép đo chính xác ở từng giai đoạn của quy trình xử lý kỹ thuật. Trung bình của các bản sao kỹ thuật gần với phép đo chính xác hơn. Hiệu quả của việc tính trung bình các bản sao kỹ thuật có thể được minh họa bằng cách lưu ý kích thước của khoảng tin cậy trong một tập dữ liệu mô phỏng với một biến thiên được xác định trước, tức là độ lệch tiêu chuẩn được thiết lập tại một. Như đã thấy trong Bảng 10,4, khoảng tin cậy trở nên nhỏ hơn với số lượng bản sao kỹ thuật ngày càng tăng (mẫu), cho thấy ước tính chính xác hơn về phép đo chính xác. Hơn nữa, việc thu hẹp khoảng tin cậy là kịch tính nhất ở số lượng bản sao kỹ thuật thấp. Tăng số lượng bản sao từ 2–3 làm giảm khoảng tin cậy từ 8,99–2,48, tức là, cải thiện hơn 3 lần độ chính xác trong ước tính của phép đo chính xác. Trong khi các bản tái tạo bổ sung tiếp tục cải thiện ước tính độ chính xác của phép đo, hiệu ứng ở cường độ giảm. Do đó, rõ ràng là trong trường hợp xử lý kỹ thuật biến thiên là một vấn đề, có thể là một lợi thế lớn để sử dụng ba lần chứ không phải là trùng lặp.
Các bản sao kỹ thuật có thể được thu thập ở một số giai đoạn trong suốt quá trình xử lý mẫu, bao gồm chiết xuất RNA, phiên mã ngược và phát hiện qPCR. Nếu các bản sao kỹ thuật được phát hiện ở nhiều giai đoạn, một thiết kế thử nghiệm lồng nhau sẽ được tạo ra. Một nghiên cứu thí điểm tận dụng thiết kế thử nghiệm lồng nhau có thể giúp xác định các giai đoạn xử lý mẫu đóng góp nhiều nhất cho các lỗi xử lý kỹ thuật và có thể tính kế hoạch lấy mẫu tối ưu dựa trên thông tin27 này.
Phân tích thống kê và Trực quan hóa dữ liệu
Phân tích khoa học về dữ liệu sinh học tập trung vào công thức và thử nghiệm các giả thuyết. Công thức của một giả thuyết đòi hỏi một sự hiểu biết chi tiết về các điều kiện và biến của xét nghiệm. Kiểm tra thành công một giả thuyết liên quan đến việc thực hiện cẩn thận và thiết kế thử nghiệm thích hợp để tối đa hóa tín hiệu quan sát được mong muốn trong khi giảm thiểu sự biến đổi kỹ thuật. Trong bối cảnh này, rất hữu ích để phân biệt giữa các nghiên cứu thăm dò và xác nhận (Hình 10,10).
Hình 10,10.Lưu đồ minh họa các hoạt động liên quan đến các phân tích thống kê thăm dò và xác nhận. Phía bên trái của hình, trước mũi tên gạch ngang, hiển thị các thao tác trong một nghiên cứu thống kê thăm dò. Phía bên phải của hình, sau mũi tên gạch ngang, hiển thị các thao tác trong nghiên cứu thống kê xác nhận.
Mục đích của nghiên cứu thăm dò là phân tích dữ liệu với một hoặc một số kỹ thuật khác nhau để chứng minh một giả thuyết. Tập hợp dữ liệu có thể được định nghĩa lại và/hoặc các kỹ thuật phân tích khác nhau có thể được sử dụng nhiều lần để hỗ trợ một hoặc một số giả thuyết. Do đó, nghiên cứu thăm dò rất linh hoạt đối với các chi tiết cụ thể của bất kỳ câu hỏi khoa học nào. Tuy nhiên, việc thăm dò lặp đi lặp lại các giả thuyết kiểm tra trên một tập dữ liệu có thể dẫn đến các vấn đề làm suy yếu kết luận thống kê. Điều này là do nhiều thử nghiệm, đề cập đến thực tế rằng một kiểm tra thống kê với một số giả thuyết độc lập có nhiều khả năng mang lại ý nghĩa tích cực và cơ hội của điều này tăng lên khi các giả thuyết bổ sung được kiểm tra, ngay cả khi phân phối xác suất cơ bản là giống hệt nhau. Để tránh gây hiểu lầm về kết quả thống kê, do đó nghiên cứu thăm dò thường được kết hợp với một nghiên cứu xác nhận.
Các yêu cầu đối với một nghiên cứu xác nhận được dựa trên các tiêu chí thống kê chặt chẽ hơn nhiều. Đầu tiên, giả thuyết nghiên cứu, bao gồm các tiêu chí cho ý nghĩa, cần được xác định trước khi thu thập dữ liệu và trước khi phân tích. Ngoài ra, tập dữ liệu để phân tích cần được thu thập riêng cho mục đích này. Về mặt thống kê, việc sử dụng lại tập dữ liệu từ nghiên cứu thăm dò trong nghiên cứu xác nhận là không chính xác vì tập dữ liệu đó vốn sẽ ủng hộ giả thuyết được đề xuất. Kết quả cuối cùng của nghiên cứu xác nhận là một giả thuyết bị từ chối hoặc được chấp nhận theo các tiêu chí được nêu trước.
Statistical Tests
Đối với xét nghiệm thống kê, khả năng một hiện tượng quan sát được xảy ra bởi ngẫu nhiên cơ hội được phân tích. Điều này được gọi là giả thuyết Null28. If the observed phenomenon is rare according to the Null hypothesis, the conclusion is that it is unlikely that the Null hypothesis is valid. Giả thuyết Null bị bác bỏ và khả năng có giả thuyết thay thế là đáng kể được chấp nhận.
Khả năng ước tính rằng hiện tượng quan sát được xảy ra bởi tình cờ ngẫu nhiên được gọi là giá trị ep thứ . Giá trị ep -th được đo trong phạm vi từ 0 đến 1, hoặc tương đương, theo đơn vị phần trăm. Các tiêu chí thống kê cho một nghiên cứu xác nhận bao gồm phần cắt giảm alpha theo đó tính giá trị dp sẽ cho biết ý nghĩa đối với hiện tượng quan sát được. Cắt giảm alpha 5% thường được sử dụng, mặc dù phải điều chỉnh để phù hợp với tiêu chí mong muốn và cần thiết dành riêng cho đối tượng nghiên cứu.
Nhiều thuật toán đã được phát triển cho các giá trị gp tính toán theo các giả định khác nhau và cho các mục đích khác nhau. Một thuật toán phổ biến là kiểm tra t Student. Kiểm tra t của Student được sử dụng để tính giá trị ap-value dựa trên sự khác biệt trong giá trị trung bình giữa hai nhóm dữ liệu. Giả định chính của kiểm tra t Student là hai nhóm dữ liệu độc lập và phù hợp với các phân bố bình thường. Một lợi thế của kiểm tra t Student là nó mạnh mẽ, so với các kiểm tra thống kê không tham số29. Kiểm tra không tham số tương đương với kiểm tra t của Student có thể là một trong những kiểm tra thống kê không tham số nổi tiếng nhất; kiểm tra tổng cấp bậc Wilcoxon (đôi khi được gọi là kiểm tra Mann-Whitney U; không nhầm lẫn với kiểm tra cấp bậc ký hiệu Wilcoxon được sử dụng để so sánh hai nhóm ghép đôi). Các kiểm tra thống kê không tham số, chẳng hạn như kiểm tra ranksum Wilcoxon, có lợi thế so với các kiểm tra thống kê tham số, chẳng hạn như kiểm tra t Student, ở chỗ chúng không phụ thuộc vào các giả định trước đó về phân bố tập dữ liệu. Kiểm tra phân phối bình thường của Kolmogorov- Smirnov có thể được sử dụng để quyết định có áp dụng kiểm tra t của Sinh viên hay không hoặc một trong những kiểm tra không tham số
Ngoài việc lựa chọn thuật toán cho phép tính giá trị rp, các tập dữ liệu được đưa vào thuật toán tính giá trị ep thứ có thể được thao tác để tạo điều kiện quan sát các thuộc tính mong muốn trong tập dữ liệu. Sự kết hợp của các bước thao tác dữ liệu thô và thuật toán tính giá trị fp là một phần của việc xây dựng một mô hình giả thuyết.
Có một mức độ tự do cao trong việc xây dựng các mô hình giả thuyết trong giai đoạn thăm dò của phân tích thống kê và đây là một phần quan trọng của cuộc điều tra khoa học. Tuy nhiên, một giả thuyết không bao giờ được chứng minh bằng cách sử dụng phương pháp khoa học thống kê. Một cách tiếp cận khoa học chính xác là xây dựng giả thuyết Null, sử dụng một tập dữ liệu độc lập (tốt nhất là một tập hợp dữ liệu mới thu thập), và chấp nhận hoặc bác bỏ giả thuyết Null theo lưu đồ nghiên cứu xác nhận (Hình 10,10).
Kỹ thuật trực quan hóa cho Phân tích Đơn biến
Cũng giống như có nhiều phương pháp phân tích có sẵn, cũng có nhiều kỹ thuật trực quan hóa dữ liệu để lựa chọn. Đối với phân tích dữ liệu đơn biến, một sơ đồ thanh đơn giản với các thanh lỗi liên kết là một kỹ thuật trực quan hóa thích hợp. Mặc dù đây là một kỹ thuật trực quan phổ biến và đơn giản, có những vấn đề đáng chú ý. Đầu tiên, các thanh lỗi có thể minh họa các nguồn khác nhau của sự biến đổi; độ biến thiên vốn có của dữ liệu (độ lệch chuẩn, SD) hoặc độ chính xác mà theo đó giá trị trung bình được xác định. Thứ hai, độ chính xác mà giá trị trung bình đã được xác định có thể được minh họa theo nhiều cách khác nhau, nhưng cuối cùng nó phụ thuộc vào sự kết hợp của sự biến đổi vốn có của dữ liệu cùng với số lượng mẫu (N) và ở dạng thô của nó, nó được gọi là sai số chuẩn của trung bình (SEM, phương trình 1):
Phương trình 1.SEM
Tuy nhiên, SEM không phải là một thước đo rất trực quan và nó không thẳng thắn để so sánh sem từ các thí nghiệm khác nhau theo một cách có ý nghĩa. Một cách phổ biến hơn để minh họa độ chính xác của giá trị trung bình ước tính và biểu thị ý nghĩa thống kê theo cách đồ họa, là khoảng tin cậy (CI, phương trình 2):
Phương trình 10-2.CL
Sự hiện diện của SEM có thể được nhận ra trong phương trình cho khoảng tin cậy là tỷ lệ giữa độ lệch chuẩn (SD) và căn bậc hai của số mẫu (N) và do đó rõ ràng rằng khoảng tin cậy dựa trên SEM. Giới hạn dưới của khoảng tin cậy được xây dựng bằng cách trừ SEM nhân với phân vị của phân bố t khỏi trung bình. Giới hạn trên của khoảng tin cậy được xây dựng bằng cách thêm SEM nhân với phân vị của phân bố t từ trung bình. Mức độ tin cậy của khoảng tin cậy được thiết lập theo mức độ tin cậy liên quan đến giá trị tới hạn t*; thường là mức tin cậy 95%.
Hình 10,1 1shows Một đồ thị cột với các thanh lỗi biểu thị khoảng tin cậy 95% trong mỗi nhóm thử nghiệm, nêu bật sự không chắc chắn liên quan đến ước tính trung bình cho biểu hiện gen mẫu trong các mẫu từ các cơ quan khác nhau sau khi điều trị với một số liều thuốc. Ngoài ra, giá trị ep thống kê kiểm tra t được thể hiện cho sự khác biệt về biểu hiện gen giữa các mẫu kiểm soát và mỗi mẫu khác nhau từ các phản ứng liều thuốc khác nhau, được biểu thị bằng ký hiệu dấu hoa thị. Theo thông lệ, có một dấu hoa thị tương ứng với ap-value dưới 0,05, hai dấu hoa thị tương ứng với ap-value dưới 0,01 và ba dấu hoa thị tương ứng với ap-value dưới 0,001.
Hình 10,11.Sự thay đổi gấp (log2) biểu hiện một gen quan tâm so với một cặp gen tham chiếu, liên quan đến biểu hiện trong mẫu với biểu hiện thấp nhất trong mỗi loại cơ quan. Độ cao thanh cho thấy biểu hiện trung bình của gen trong một số mẫu trong các nhóm mẫu hoặc mẫu không được điều trị (liều 0) được điều trị ở một trong ba liều thuốc khác nhau (liều 1, liều 2 và liều 3). Thanh lỗi cho biết ước tính khoảng tin cậy 95% của biểu thức trung bình. Một dấu hoa thị cho biết sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê giữa các phương tiện của tập hợp mẫu đã xử lý so với giá trị trung bình của tập hợp mẫu không được xử lý là 5%; hai dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể về mặt thống kê là 1%; ba dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đến 0,1%.
Cho rằng ký hiệu dấu hoa thị ẩn giá trị tuyệt đối o fp, thường nên bao gồm một bảng với các giá trị tuyệt đối o fp, như được thể hiện trong ví dụ trong Bảng 10,5. Một lý do đằng sau điều này là giá trị ap -của Ví dụ 0,032 chỉ "đáng kể" hơn một chút so với giá trị ap -của 0,055. Các trường hợp ranh giới như thế này có thể dẫn đến một số nhầm lẫn khi quyết định chính xác loại bỏ để sử dụng khi phân loại dữ liệu là đáng kể. Trong các trường hợp thực tế, ap-value của 0,051 có thể cũng đáng kể như ap-value của 0,049, nhưng một sự cắt giảm nghiêm ngặt (mặc dù về cơ bản là tùy ý) của 0,05 sẽ phân loại một là đáng kể và một là không.
Tuy nhiên, có một biến thể của trực quan hóa sơ đồ thanh tận dụng khoảng tin cậy của sự khác biệt giữa các phương tiện để tránh nhiều nhược điểm của sơ đồ thanh truyền thống24. Với khoảng tin cậy của sự khác biệt giữa các phương tiện, có thể ước tính trực tiếp ý nghĩa thống kê với các thanh lỗi liên quan trong khi đồng thời nhấn mạnh kích thước hiệu ứng sinh học và sự biến đổi dữ liệu. Hình 10,1 2shows Biến thể với khoảng tin cậy của sự khác biệt giữa các phương tiện của dữ liệu được sử dụng trong Hình 10,11. Lưu ý rằng khoảng tin cậy không bao gồm sự khác biệt 0 giữa các phương tiện tương ứng với kết quả đáng kể ở mức tin cậy tương ứng với khoảng cắt giá trị ep thứ ep (5% trong Hình 10,1 1and Bảng 10,5).
Hình 10,12.Sơ đồ thanh cho thấy sự khác biệt giữa các phương tiện của tập hợp mẫu không được xử lý (liều 0) và một trong các tập hợp mẫu đã xử lý (liều 1, liều 2 hoặc liều 3) trong tập dữ liệu từ Hình 10,11. Thanh lỗi hiển thị khoảng tin cậy của sự khác biệt giữa các phương tiện. Các thanh lỗi không cắt ngang trục x cho biết các phương tiện so sánh tương ứng có ý nghĩa thống kê đến 5% trong kiểm tra t. PCR Technology, Current Innovations-3rd ed. bởi Taylor and Francis Group LLC Books. Được sao chép với sự cho phép của Taylor và Francis Group LLC Books ở định dạng tái sử dụng trong sách / sách điện tử thông qua Trung tâm chứng nhận bản quyền.
Dữ liệu đa biến là dữ liệu được thu thập trên một số biến cho mỗi đơn vị lấy mẫu. Dữ liệu được sử dụng trong hình 10,1 1and 10,1 2are đa biến ở chỗ chúng phụ thuộc vào các biến số như liều lượng và loại cơ quan. Tuy nhiên, các phân tích thống kê trong các hình 10,1 1and 10,1 2are tuy nhiên thống nhất ở chỗ mỗi biểu diễn (bar) chỉ minh họa một biến, biểu thức gen, so với các phép đo cố định của các biến khác. Đối với các kỹ thuật phân tích dữ liệu đa biến, phân cụm phân cấp và phân tích thành phần chính là các tùy chọn tốt để biểu diễn dữ liệu.
Phân nhóm theo thứ bậc
Một trong những phương pháp dễ dàng và hữu ích nhất để mô tả dữ liệu là bằng cách vẽ các dữ liệu trong một biểu đồ tán xạ (ví dụ vẽ các giá trị CQ đo được của một gen so với các giá trị CQ tương ứng của một gen khác cho một tập hợp các mẫu sinh học trong một biểu đồ 2D). Các cốt truyện trong một hoặc hai kích thước được hình dung thuận tiện bằng mắt người. Các đồ thị trong ba chiều cũng có thể có được với các công cụ thích hợp, nhưng các đồ thị kích thước cao hơn khó hình dung hơn đáng kể. Tuy nhiên, đối với các nghiên cứu thăm dò, tập dữ liệu vốn là đa chiều và các biểu đồ tán xạ của toàn bộ tập dữ liệu do đó có thể trở nên không thực tế. Từ một tập dữ liệu qPCR, ví dụ, có thể có một số gen và / hoặc một số loại mẫu sinh học được đại diện.
Một cách phổ biến, thay thế để mô tả và trực quan hóa dữ liệu từ các nghiên cứu thăm dò là phân tích các biện pháp đo khoảng cách giữa các điểm dữ liệu trong đồ thị tán xạ. Các biện pháp khoảng cách khác nhau tồn tại, bao gồm tương quan Euclide, Manhattan và Pearson. Với sức mạnh tính toán, việc tính toán khoảng cách rất đơn giản, ngay cả đối với dữ liệu đa chiều có chiều cao hơn nhiều so với ba chiều. Đối với phân cụm phân cấp kết tụ, quá trình lặp sau đây được thực hiện: 1) Tìm hai đối tượng gần nhất và hợp nhất chúng thành một cụm; 2) xác định cụm mới là một đối tượng mới thông qua phương pháp cụm; 3) Lặp lại từ 1) cho đến khi tất cả các đối tượng đã được kết hợp thành cụm30. Các phương pháp thay thế cho các phương pháp phân cụm bao gồm phương pháp Ward, liên kết đơn và liên kết trung bình31. Một dendrogram thường được sử dụng để trực quan hóa kết quả từ phân nhóm.
Việc giải thích các nhánh phân cấp của dữ liệu qPCR thường dẫn đến kết luận về các tương đồng về biểu hiện gen. Trong một nghiên cứu thăm dò, những điểm tương đồng này sau đó có thể được sử dụng để xây dựng các giả thuyết về sự đồng điều biểu hiện gen, có thể được chấp nhận hoặc từ chối trong các nghiên cứu xác nhận tiếp theo. Các ưu điểm của các biến trở cụm phân cấp bao gồm độ rõ ràng mà theo đó các mối quan hệ tương đồng được hình dung. Mặt khác, sự nhấn mạnh mạnh vào các biện pháp tương tự có thể được coi là hạn chế đối với các giả thuyết xây dựng, vì các hồ sơ biểu hiện tương tự có thể là các thuộc tính dư thừa trong các giả thuyết. Nó có thể có giá trị cao hơn để xác định các tập hợp các biểu thức bổ sung cho nhau trong một tổ hợp cụ thể, để trả lời giả thuyết mong muốn.
Phân tích thành phần chính
Một cách khác phổ biến, thay thế để mô tả và trực quan hóa dữ liệu từ các nghiên cứu thăm dò là tận dụng lợi thế của thông tin chứa trong toàn bộ tập dữ liệu đa chiều, chọn các thuộc tính mong muốn và chiếu nó đến một biểu đồ tán xạ chiều thấp hơn, chẳng hạn như một biểu đồ 2D hoặc 3D. Điều này có thể đạt được bằng cách sử dụng phân tích thành phần chính (PCA)32,33,34, 35. Ở đây, hệ tọa độ ban đầu của tập dữ liệu (tức là các hồ sơ biểu thức đo bằng qPCR) được chuyển đổi thành một không gian đa chiều mới nơi các biến mới (thành phần chính: Máy tính hoặc các yếu tố) được xây dựng. Mỗi máy tính là một tổ hợp tuyến tính của các đối tượng trong bộ dữ liệu gốc. Theo định nghĩa toán học, máy tính được trích xuất theo thứ tự quan trọng liên tiếp. Điều này có nghĩa là máy tính đầu tiên giải thích hầu hết thông tin (phương sai) có trong dữ liệu, máy tính thứ hai ít hơn, v.v... Do đó, hai hoặc ba tọa độ PC đầu tiên (được gọi là điểm số) có thể được sử dụng để có được một phép chiếu của toàn bộ dữ liệu được đặt vào một chiều nhỏ thuận tiện, thích hợp để trực quan hóa trong một biểu đồ 2D hoặc 3D. Bằng cách sử dụng hai hoặc ba máy tính đầu tiên để biểu diễn, phép chiếu giải thích cho sự biến đổi nhất trong tập dữ liệu thu được. Phương sai từ các điều kiện thiết kế thực nghiệm dự kiến là có hệ thống, trong khi phương sai đồng nhất dự kiến là ngẫu nhiên, vì vậy biểu diễn này có thể được mong muốn trong các điều kiện thích hợp.
Như đã lưu ý trước đây đối với phân nhóm phân cấp, việc giải thích QPCR PCA thường dẫn đến kết luận về sự tương đồng hồ sơ biểu hiện gen. Mặc dù PCA và phân nhóm có thể mang lại những hiểu biết bổ sung vào các mẫu đồng điều hòa biểu hiện gen, cả hai kỹ thuật đều tập trung vào các điểm tương đồng hồ sơ biểu hiện gen. Điều này đặt ra những hạn chế về các loại giả thuyết có thể được tìm thấy trong các nghiên cứu thăm dò bằng cách sử dụng các kỹ thuật này một mình. Để mở rộng phạm vi của các giả thuyết được tạo ra trong các nghiên cứu thăm dò, một cách tiếp cận giả thuyết đối với phân tích đa biến gần đây đã được đề xuấtnăm 24. Các thuật toán thiết kế tùy chỉnh, dựa trên giả thuyết có thể xác định các giả thuyết liên quan đến sinh học có thể bị bỏ qua bởi các kỹ thuật thường được sử dụng để phân tích dữ liệu đa biến.