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Sterilitätsprüfung

Die Sterilitätsprüfung ist eine entscheidende GMP-Anforderung, um sicherzustellen, dass Arzneimittel, Medizinprodukte, Biologika sowie Zell- und Gentherapien vor der Verabreichung an Patienten frei von lebensfähigen Mikroorganismen sind. Eine nicht bestandene Sterilitätsprüfung – sei es ein echtes positives oder ein falsches Ergebnis – hat erhebliche Konsequenzen: Produktrückrufe, Risiken für die Patientensicherheit und kostspielige behördliche Untersuchungen.

Angesichts sich weiterentwickelnder Arzneibuchstandards und einer verschärften behördlichen Kontrolle müssen moderne Sterilitätsprüfungsprogramme drei miteinander verbundene Herausforderungen bewältigen: methodische Genauigkeit, Datenintegrität und schnelle Freigabe. Das Verständnis der verfügbaren Sterilitätsprüfverfahren, ihrer regulatorischen Rahmenbedingungen sowie der neuesten Fortschritte bei digitalen Arbeitsabläufen und schnellen mikrobiologischen Methoden ist für jedes nach GMP arbeitende Qualitätskontrolllabor unerlässlich.

Von der Auswahl der richtigen Prüfmethode für Ihr Produkt und Ihr Verpackungsformat bis hin zur Erfüllung der sich weiterentwickelnden behördlichen Anforderungen hinsichtlich Datenintegrität und Freigabegeschwindigkeit führt Sie dieser Leitfaden durch alle wichtigen Aspekte der Sterilitätsprüfung. 

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Methoden zur Sterilitätsprüfung von Arzneimitteln

Die in den Arzneibüchern festgelegten Sterilitätsprüfungen für pharmazeutische Produkte unterliegen den Vorschriften von USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>, wonach Proben über einen Inkubationszeitraum von 14 Tagen in zwei getrennten Nährmedien kultiviert werden müssen. Zur Gewährleistung einer umfassenden Erfassung von Mikroorganismen werden zwei Nährmedien verwendet: das Fluid Thioglycolate Medium (FTM) für anaerobe und aerobe Bakterien (inkubiert bei 32,5 °C) und das Soybean Casein Digest Medium (SCDM), auch Trypticase Soy Broth (TSB) genannt, für aerobe Bakterien und Pilze (inkubiert bei 22,5 °C). Jede nach der Inkubation festgestellte Trübung deutet auf eine mögliche mikrobielle Kontamination hin und muss untersucht werden.

Es sind zwei in den Arzneibüchern anerkannte Methoden: die Membranfiltration und die direkte Inokulation. Die Wahl der Methode hängt von der Art des Produkts, seiner Verpackungsform und seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften ab. Sofern die Art des Produkts dies zulässt, ist die Membranfiltration gemäß USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06> die Methode der Wahl, da sie eine höhere Empfindlichkeit aufweist und hemmende Substanzen entfernen kann. Die direkte Beimpfung bleibt anwendbar, wenn eine Filtration nicht durchführbar ist.

Während die 14-tägige Inkubationszeit weiterhin der pharmakopöische Standard ist, werden schnelle mikrobiologische Methoden (RMMs) auf Basis der ATP-Biolumineszenz-Technologie von den Zulassungsbehörden zunehmend für Produkte mit kurzer Haltbarkeit, einschließlich Zell- und Gentherapien, akzeptiert. Das neue Kapitel USP <73> – „Auf ATP-Biolumineszenz basierende mikrobiologische Verfahren zum Nachweis von Kontaminationen in Produkten mit kurzer Haltbarkeit“ – bietet einen klaren regulatorischen Rahmen für die Einführung von RMMs sowie für die Validierung und Umsetzung dieser Technologie, gültig ab August 2025.

Unabhängig von der gewählten Methode gelten die Anforderungen an die Datenintegrität gleichermaßen für alle Arbeitsabläufe bei Sterilitätsprüfungen: Alle Prüfdaten müssen vollständig rückverfolgbar, auditfähig und konform mit ALCOA++, 21 CFR Part 11 und EU-Anhang 11 sein – vom Probenempfang bis zur Erfassung des Endergebnisses.

Sterilitätsprüfung mittels Membranfiltration

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Mit über 50 Jahren Erfahrung als Pionier der Branche bietet die Steritest®-Lösung robuste und sichere Sterilitätsprüfungen für zuverlässige Ergebnisse. Die Membranfiltration ist die gemäß den Vorschriften bevorzugte Methode für filtrierbare pharmazeutische Produkte gemäß USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>. Die Probe wird durch einen 0,45-µm-Membranfilter geleitet, wo Mikroorganismen zurückgehalten und anschließend in geeigneten Nährmedien kultiviert werden.

Diese Methode bietet gegenüber der direkten Beimpfung entscheidende Vorteile:

  • Höhere Empfindlichkeit – die gesamte Probe oder eine Mischprobe wird durch eine einzige Membran gefiltert
  • Entfernung von Inhibitoren – antimikrobielle Verbindungen wie Antibiotika oder Konservierungsstoffe können vor der Inkubation ausgespült werden, wodurch falsch-negative Ergebnisse verhindert werden
  • Schutz durch ein geschlossenes System – moderne Filtrationsgeräte mit geschlossenem System stellen sicher, dass das Produkt während der Prüfung zu keinem Zeitpunkt der Umgebung ausgesetzt ist, was das Risiko einer Fremdkontamination und ungültiger Prüfergebnisse erheblich verringert

Der Einsatz von geschlossenen Einweg-Membranfiltrationsgeräten gilt als bewährtes Verfahren in GMP-konformen Sterilitätsprüfumgebungen, sowohl in Laminar-Flow-Hauben als auch in Isolatoren.

Sterilitätsprüfung durch direkte Beimpfung

Bei der Sterilitätsprüfung durch direkte Beimpfung wird ein kleines Probenvolumen aseptisch in ein geeignetes Wachstumsmedium überführt und inkubiert. Diese Methode ist zwar einfach durchzuführen, weist jedoch einige Einschränkungen auf, die Labore berücksichtigen sollten:

  • Geringere Empfindlichkeit – es können nur kleine Probenmengen inokuliert werden, was das Risiko erhöht, geringfügige Kontaminationen zu übersehen
  • Beeinflussung durch Trübung – von Natur aus trübe oder gefärbte Produkte können das mikrobielle Wachstum bei der visuellen Untersuchung überdecken
  • Antimikrobielle Hemmung – Produkte mit antimikrobiellen Eigenschaften müssen vor der Beimpfung neutralisiert werden, um falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden

Schnelle mikrobiologische Verfahren (RMM) zur Sterilitätsprüfung

Da sich die regulatorischen Rahmenbedingungen weiterentwickeln, um Innovationen Rechnung zu tragen, finden schnelle mikrobiologische Methoden (RMMs) zunehmend Akzeptanz als wissenschaftlich validierte Alternativen zu herkömmlichen Sterilitätsprüfungen nach Arzneibuch. RMMs sind besonders relevant für Produkte mit kurzer Haltbarkeit – wie Zell- und Gentherapien, Radiopharmaka und kurzlebige Biologika –, bei denen eine 14-tägige Inkubationszeit nicht mit den Zeitplänen für die Produktfreigabe oder den Behandlungsplänen der Patienten vereinbar ist.

Zu den etabliertesten RMM-Technologien zählt die ATP-Biolumineszenz, bei der das von lebensfähigen Mikroorganismen nach der Reaktion mit einem Biolumineszenz-Reagenz emittierte Licht erfasst wird, was einen schnellen, empfindlichen und quantitativen Nachweis von Kontaminationen ermöglicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen inkubationsbasierten Methoden ersetzt die ATP-Biolumineszenz die subjektive visuelle Trübungsbeurteilung durch eine quantitative, instrumentengestützte Messung und ermöglicht so eine frühzeitigere und reproduzierbarere Interpretation der Ergebnisse.

Die Einführung von USP <73> – „ATP-Biolumineszenz-basierte mikrobiologische Methoden zum Nachweis von Kontaminationen in Produkten mit kurzer Haltbarkeit“, gültig ab August 2025 – stellt einen bedeutenden regulatorischen Meilenstein dar und bietet Laboren einen klaren pharmakopöischen Rahmen für die Umsetzung und Validierung von RMM-basierten Sterilitätsprüfungen. Ergänzt wird dies durch USP <1071>, das umfassendere Leitlinien zur Umsetzung und Validierung schneller mikrobiologischer Verfahren bietet.

RMMs eignen sich nicht nur für Sterilitätsprüfungen von Endprodukten, sondern auch für die prozessbegleitende Überwachung der Keimbelastung während des gesamten Herstellungsablaufs und bieten Laboren eine vielseitige und konforme Lösung für zahlreiche Anwendungen in der Qualitätskontrolle.

Das Milliflex® Rapid System 2.0 entspricht vollständig den Anforderungen von USP <73> und ermöglicht es Ihrem Labor, einen validierten, konformen, auf RMM basierenden Arbeitsablauf für Sterilitätsprüfungen zu implementieren – mit Ergebnissen in maximal 5 Tagen.

Datenintegrität und Datenverwaltung bei Sterilitätsprüfungen

Ein Sterilitätsprüfergebnis ist nur so zuverlässig wie die ihm zugrunde liegenden Daten – und Aufsichtsbehörden weltweit stellen die Datenintegrität in den Mittelpunkt der Einhaltung der GMP-Vorgaben für die Mikrobiologie. Neben der Methodik wird ebenso viel Wert darauf gelegt, wie Sterilitätsprüfdaten während des gesamten Prüfzyklus generiert, erfasst und gepflegt werden. Aufsichtsbehörden wie die FDA, die EMA und die PMDA verlangen, dass alle Labordaten den ALCOA++-Prinzipien entsprechen: Daten müssen zuordenbar, lesbar, zeitnah, original und genau sein, wobei zusätzliche Anforderungen hinsichtlich Vollständigkeit, Konsistenz und Verfügbarkeit bestehen.

In den USA definiert 21 CFR Part 11 die Anforderungen an elektronische Aufzeichnungen und elektronische Signaturen, wodurch digitale Dokumentation rechtlich mit Papieraufzeichnungen gleichgestellt wird. In Europa legt der EU-Anhang 11 entsprechende Anforderungen für computergestützte Systeme in GMP-Umgebungen fest. Zusammen bilden diese Vorschriften einen klaren Rahmen für die Datenintegrität von QC-Labordaten, einschließlich Sterilitätsprüfungen: Die Erfassung von Daten in Echtzeit, die automatische Erstellung von Prüfpfaden und die lückenlose digitale Rückverfolgbarkeit – von der Identifizierung des Bedieners und den Gerätedaten bis hin zu Probeninformationen und Endergebnissen – werden von den Aufsichtsbehörden bei GMP-Inspektionen zunehmend erwartet und gelten als bewährte Praxis in der Branche. Die M-Trace®-Software und die mobile App helfen Ihrem Labor dabei, diese regulatorischen Anforderungen zu erfüllen. 

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Anwendungen der Sterilitätsprüfung: Von Arzneimitteln bis hin zu Zell- und Gentherapien

Sterilitätsprüfungen sind eine routinemäßige Anforderung der Qualitätskontrolle in einer Vielzahl von GMP-regulierten Branchen. Während die grundlegenden Prinzipien einheitlich bleiben, variieren die Wahl der Methode, der regulatorische Rahmen und die Anforderungen an die Schnelligkeit der Ergebnisse je nach Segment erheblich:

  • Arzneimittel – darunter Injektionspräparate, Augenarzneimittel und Infusionslösungen – machen den größten Anteil an Sterilitätsprüfungen aus und unterliegen den Vorgaben von USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>
  • Biologika, Biosimilars und Impfstoffe – sterile parenterale Produkte, die strenge Chargenfreigabetests gemäß GMP erfordern
  • Medizinprodukte – an die Produktform angepasste Sterilitätsprüfungen unter Verwendung von Direktübertragungs- oder Produktspülverfahren
  • Zell- und Gentherapien (CGT) sowie ATMPs – Produkte mit kurzer oder extrem kurzer Haltbarkeit, bei denen schnelle mikrobiologische Methoden oft die einzige praktikable Option für Freigabeentscheidungen am selben oder am nächsten Tag sind
  • Radiopharmazeutika – Produkte mit Halbwertszeiten im Stundenbereich, bei denen eine herkömmliche 14-tägige Inkubation nicht durchführbar ist und schnelle mikrobiologische Methoden (RMMs) zunehmend vorgeschrieben werden
  • Gewebe- und regenerative Medizin – Sterilitätsnachweis vor der Transplantation oder Verabreichung"

Arbeitsabläufe zur Sterilitätsprüfung  

Herkömmlicher, nach Arzneibüchern durchgeführter Arbeitsablauf – Membranfiltration

Der folgende Schritt-für-Schritt-Ablauf beschreibt die Sterilitätsprüfung mittels Membranfiltration gemäß USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>. 

Vorbereitung der Prüfung – Die Membranfiltrationsvorrichtung zusammenbauen und die Schläuche an die Sterilitätsprüfpumpe in der kontrollierten Umgebung (Laminar-Flow-Haube oder Isolator) anschließen 

  1. Spülen der Membran/Vorbefeuchtung des Filters – Befeuchten Sie die Membran vorab, um die Filtrationseffizienz zu optimieren und die Adsorption des Produkts am Filter zu minimieren
  2. Probenfiltration — Filtern Sie gleiche Produktmengen in beide Behälter; Mikroorganismen werden auf der 0,45-µm-Membran
    zurückgehalten
  3. Spülen – Entfernen Sie hemmende Verbindungen mit einer validierten Spüllösung, um falsch-negative Ergebnisse
    zu vermeiden
  4. Befüllung mit Nährmedien — Befüllen Sie die Membranfiltrationsvorrichtungen mit den sterilen Nährmedien
    SCDM (TSB) und FTM
  5. Inkubation – 14 Tage bei 32,5 °C (FTM) und 22,5 °C (SCDM). Diese Temperaturen entsprechen den Mittelwerten der in den Arzneibüchern festgelegten Bereiche von 30–35 °C bzw. 20–25 °C, wie in USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>
    angegeben
  6. Befundauswertung – Visuelle Trübungsprüfung; jede Trübung muss als potenzielle mikrobielle Kontamination
    untersucht werden
  7. Digitale Prüfprotokollierung — Die zeitgleiche, automatische Erfassung aller Prüfschritte, Bedieneraktionen und Gerätedaten in einem einzigen, nachprüfbaren elektronischen Protokoll unterstützt die Einhaltung von 21 CFR Part 11, der ALCOA++-Prinzipien zur Datenintegrität sowie die Bereitschaft für behördliche Inspektionen

Die Schrittbeschreibungen entsprechen den Anforderungen der Arzneibücher USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP <4.06>. Schritt 8 spiegelt die aktuellen behördlichen Erwartungen an die Datenintegrität gemäß 21 CFR Part 11 und EU-Anhang 11 wider, die über die Anforderungen der Arzneibücher hinausgehen.

Workflow für schnelle Sterilitätsprüfungen – ATP-Biolumineszenz

Bei Produkten mit kurzer Haltbarkeit – darunter Zell- und Gentherapien, Radiopharmaka und kurzlebige Biologika – ist die herkömmliche 14-tägige Inkubationszeit oft nicht mit den Zeitplänen für die Produktfreigabe vereinbar. Schnelle mikrobiologische Verfahren (RMMs) bieten eine wissenschaftlich validierte und behördlich anerkannte Alternative.

Die ATP-Biolumineszenz ist eine der etabliertesten RMM-Technologien für Sterilitätsprüfungen. Sie erfasst das Licht, das von lebensfähigen Mikroorganismen nach der Reaktion mit einem Biolumineszenz-Reagenz emittiert wird, und ermöglicht so einen schnellen, empfindlichen und quantitativen Nachweis von Kontaminationen. Das neue Kapitel USP <73> – „Auf ATP-Biolumineszenz basierende mikrobiologische Methoden zum Nachweis von Kontaminationen in kurzlebigen Produkten“ – bietet einen klaren regulatorischen Rahmen für die Einführung von RMM, der ab August 2025 in Kraft tritt.

Ein typischer Arbeitsablauf für einen ATP-Biolumineszenz-Schnelltest zur Sterilitätsprüfung verläuft wie folgt:

  1. Probenfiltration – Die Probe wird durch eine spezielle Membran filtriert, die lebensfähige Mikroorganismen zurückhält
  2. Aufbringen des ATP-Reagenzes – Biolumineszenz-Reagenzien werden auf die Membran aufgebracht und binden an lebensfähige Zellen
  3. Automatische Detektion und Quantifizierung – Eine hochempfindliche Detektionskamera erfasst und quantifiziert die Lichtsignale lebensfähiger Mikroorganismen
  4. Ergebnisse in maximal 5 Tagen — Die Ergebnisse liegen bis zu 75 % schneller vor als bei der herkömmlichen 14-tägigen Methode gemäß dem Arzneibuch. Die tatsächliche Zeit bis zum Ergebnis hängt von der validierten Methode und der Produktart ab.
  5. Elektronisches Prüfprotokoll — Alle Ergebnisse werden in einem 21 CFR Part 11-konformen, vollständig nachprüfbaren digitalen Protokoll erfasst

Dieser Arbeitsablauf basiert auf der ATP-Biolumineszenz-Technologie, wie in USP <73> beschrieben. Schritt 5 entspricht den aktuellen behördlichen Anforderungen an die Datenintegrität und die elektronische Protokollierung gemäß 21 CFR Part 11 und EU-Anhang 11.

RMMs, die die ATP-Biolumineszenz nutzen, eignen sich sowohl für Sterilitätsprüfungen als auch für die Überwachung der Keimbelastung während des Produktionsprozesses und bieten Laboren eine vielseitige, schnelle und konforme Lösung für den gesamten Fertigungsablauf.

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