Metodika iontové výměny

Aby mohlo dojít k elektrostatické retenci, musí být funkční skupiny analytu i sorbentu ve své ionizované formě. Toho se dosáhne přísnou kontrolou pH matrice vzorku. U zásaditých analytů je třeba upravit pH alespoň o 2 jednotky pH pod pKa molekuly. U kyselých analytů je třeba upravit pH alespoň o 2 jednotky pH nad pKa molekuly.

Pro eluci platí opačný postup. Úpravou pH eluantu na hodnotu alespoň o dvě jednotky pH vyšší nebo nižší než pKa analytů a/nebo sorbentu lze účinně neutralizovat jednu nebo obě funkční skupiny, čímž se naruší elektrostatická interakce a umožní se eluce.

Poznámka: Protože kinetické procesy výměny mezi funkčními skupinami vzorku a sorbentu jsou u iontové výměny podstatně pomalejší než u normální a obrácené fáze, průtok by měl být kapkový (~1 kapka/sekundu). Může být také nutné zvýšit eluční a promývací objemy a poskytnout dostatečnou dobu setrvání pro interakci mobilní a stacionární fáze.

Obrázek 1. Metodika iontové výměny

Selektivita protiiontů & iontová výměna:

Selektivita protiiontů je definována jako míra, do jaké je protiiont schopen soutěžit s jinými protiionty o funkční skupinu sorbentu iontoměniče. Retence je usnadněna tím, že sorbent a/nebo matrice vzorku jsou předem připraveny s protiiontem, který je méně selektivní než funkční skupina analytu (minimální konkurence). Eluce analytu je usnadněna použitím pufrů s protiionty selektivnějšími než funkční skupina analytu.

Pro kationtové měniče:

• Ca²⁺ > Mg²⁺ > K⁺ > Mn²⁺ > RNH₃ ^.2+ > NH₄⁺ > Na⁺ > H⁺ > Li⁺

Pro aniontové výměníky:

• Benzensulfonát > Citrát > HSO₄^- > NO₃^{-<-/sup> > HSO₃- > NOsub>2- > Cl- > HCO₃- > HPO₄- > mravenčan > acetát > propionát > F- > OH-}

Chcete-li přejít na vyšší selektivní ion, propusťte přes sorbent 2-5 objemů lůžka 1N roztoku nového protiiontu. Chcete-li změnit na nižší selektivní ion, propusťte přes sorbent 5-65 objemů 1N roztoku nového protiiontu.

Poznámka: Počet objemů lože závisí na tom, o kolik je nový protiiont méně selektivní než stávající protiiont na sorbentu.

Základní kroky

1. Předúprava vzorku Koncentrace soli by měla být menší než 0,1M. Vzorek zřeďte v poměru 1:1 s pufrem o vhodném pH, abyste zajistili ionizaci funkčních skupin analytu.
   Příklady:
   • Základní sloučeniny: zřeďte s 10-25 mM pufrem (např. fosforečnanem draselným nebo octanem amonným), pH 3-6
   • Kyselé sloučeniny: zřeďte s 10-50 mM pufrem (např, acetátovým pufrem), pH 7-9
   
   Pro vzorky zatížené interferencemi (např, biologické tekutiny), které obsahují různé úrovně koncentrace solí, použijte technologii SPE se smíšeným režimem.
   
   
2. Kondicionování/ekvilibrace Pokud jsou vzorky v nepolárním rozpouštědle, mělo by se ke kondicionování zařízení SPE použít stejné rozpouštědlo. V případě vodných vzorků kondicionujte 1-2 objemy zkumavky s metanolem nebo acetonitrilem. Vyrovnejte pufrem s podobným/identickým pH a koncentrací solí jako pufr použitý při předúpravě vzorku.
   
   
3. Zatížení vzorku Naneste vzorek (z kroku 1) při konstantní a snížené průtokové rychlosti ~ 1-2 kapky za sekundu, abyste zajistili optimální retenci. Kinetika přenosu hmoty u iontově-výměnné SPE je pomalejší než u reverzní a normální fáze. Snížená průtoková rychlost je rozhodující pro konzistentní výtěžnost.
   
   
4. Vymývání Je třeba udržovat odpovídající kontrolu pH a iontové síly, aby se zabránilo předčasnému vymývání zájmových analytů. K odstranění polárních interferencí použijte pufr o vhodném pH (např. pufr používaný při předúpravě vzorku). Hydrofobnější interference lze odstranit použitím až 100% metanolu zředěného v pufru pro předúpravu vzorku.
   
   
5. Eluce Eluce probíhá při konstantní a snížené průtokové rychlosti ~1-2 kapky/sekundu, aby byla zajištěna optimální desorpce sloučenin. Nejběžnější strategií eluce je manipulace s pH. Také většina iontoměničů vykazuje určité chování ve smíšeném režimu. K narušení sekundárních interakcí na reverzní fázi je nutné přidat organický modifikátor.
   Příklady:
   
   • Základní sloučeniny: eluujte 2-5% hydroxidem amonným v 50-100% metanolu
   • Kyselé sloučeniny: eluujte 2-5% kyselinou octovou v 50-100% metanolu.
   
   Další strategie eluce:
   • Použijte eluát SPE o vyšší koncentraci soli (> 1M)
   • Použijte selektivnější protiiont, který bude soutěžit o iontově-výměnná vazebná místa
   /li>
   
   
6. Dodatečná úprava eluátu K dispozici je řada elučních strategií. Různé eluční strategie by měly být testovány a optimalizovány, aby se minimalizovalo následné zpracování eluátu.