Metoda LC/MS/MS pro stanovení glyfosátu, AMPA a glufosinátu v obilovinách
Úvod
Glyfosát je jedním z nejčastěji používaných herbicidů na světě. Jeho používání se výrazně zvýšilo po zavedení geneticky modifikovaných plodin tolerantních ke glyfosátu, jako je kukuřice, sója a bavlna. V současné době se na polích ročně aplikuje více než 1,4 miliardy liber glyfosátu.1 Dokument s předpisy US EPA CFR-title 40-volume 24 stanovuje toleranční úrovně pro výskyt glyfosátu v potravinářských komoditách a produktech.2
EPA stanovila toleranční úrovně pro rezidua glyfosátu v obilovinách (nazývaných také skupina plodin 15) na 30 ppm. Tyto hodnoty nezahrnují rýži, sóju a kukuřici. U rýže je tolerance 0,1 ppm, zatímco u kukuřice je to 3,5 ppm.2 U glufosinátu, herbicidu, který je v analytických metodách často zahrnován do glyfosátu, jsou hodnoty tolerance 0,4 ppm pro obiloviny a 1,0 ppm pro rýži. Tyto hodnoty tolerance zahrnují metabolity a degradanty. Proto byl do této studie zahrnut také metabolit glyfosátu (kyselina aminomethyl)-fosfonová (AMPA) (obrázek 1).
Obrázek 1. Struktura glyfosátu, AMPA a glufosinátu
Jelikož se glyfosát hojně používá při pěstování sóji a kukuřice, očekávalo se, že se v těchto komoditách bude vyskytovat. V této aplikaci jsme se zaměřili na zkoumání přítomnosti glyfosátu v dalších obilovinách (oves a pšenice) používaných k výrobě snídaňových cereálií, včetně cereálních výrobků pro kojence.
V průběhu posledních 30 let byly vyvinuty různé metody analýzy glyfosátu. Některé z nich vyžadovaly derivatizaci analytů pro HPLC s fluorescenční detekcí pomocí oftalaldehydu.3 Metoda s derivatizací glyfosátu pomocí fluorenylmetylkarbonylchloridu (FMOC) a fluorescenční detekcí byla navržena a používána některými laboratořemi.4 V poslední době, s příchodem moderních, citlivějších a robustnějších LC/MS/MS přístrojů, je možné analyzovat glyfosát a jeho metabolity bez derivatizace. V této práci jsme použili přímou analýzu glyfosátu pomocí MS/MS.
Experimentální
Pro potvrzení účinnosti metody byly použity organické instantní ovesné vločky a organická celozrnná pšeničná mouka. Tyto potraviny byly skenovány na přítomnost glyfosátu a žádný nebyl nalezen. Celozrnná pšeničná mouka byla použita v nezměněném stavu a ovesné vločky byly před použitím rozemlety. Pro účely studie účinnosti metody byly obě matrice obohaceny o 100 ppb glyfosátu a 100 ppb glufosinátu.
Oves byl také obohacen o 100 ppb AMPA. Byla také zakoupena organická kukuřičná mouka, která byla testována na přítomnost glyfosátu a bylo zjištěno, že neobsahuje glyfosát. Stejnou metodiku lze použít i pro testování kukuřičné mouky a výrobků z kukuřice.
Pro screeningové studie byly vyvinutými metodami testovány na přítomnost glyfosátu následující matrice: bílá mouka, instantní ovesné vločky, rýžové cereálie pro kojence, ovesné cereálie pro kojence a směsné cereálie pro kojence.
Předúprava vzorků
Extrakční metoda vycházela z metodiky QuPPe (Quick Polar Pesticides Method) vyvinuté v Evropské unii (EU) pro ovoce a zeleninu a jako konečné extrakční rozpouštědlo se používala voda:metanol (50:50) s obsahem kyseliny mravenčí.5 Pětigramový vzorek homogenizovaného zrna nebo obiloviny byl navážen do 50ml odstředivé zkumavky. Byla přidána voda (10 ml) a 100 μl roztoku vnitřního standardu (20 μg/ml každého analytu ve vodě). Vzorky se poté nechaly stát 30 minut až dvě hodiny. Poté bylo přidáno 10 ml methanolu obsahujícího 1 % v/v kyseliny mravenčí. Vzorky byly 15 minut míchány na laboratorní třepačce a odstředěny. Dva vzorky použité při ověřování, oves a pšenice, poskytly výrazně odlišné extrakty. Zatímco oves poskytl čirý, žlutý extrakt, pšeničný extrakt byl zakalený a obtížně filtrovatelný. V důsledku toho byly pro různé vzorky obilovin použity dva různé postupy čištění vzorků.
Čištění vzorků pomocí SPE
U vzorků, které po extrakci a odstředění neobsahovaly pevné částice, bylo použito čištění extrakcí na pevné fázi (SPE) pomocí kazety Supel™- Select HLB, podobně jako u metody, kterou uvádějí Chamkasem a Harmon.6 HLB kazety byly kondicionovány pomocí 100% methanolu a následně vody:methanolu (50:50) s obsahem 0,5 % v/v kyseliny mravenčí. U 1 ml SPE kazet bylo k dalšímu kondicionování použito 0,5 ml extraktu vzorku. Eluát z tohoto kroku kondicionování byl zlikvidován. Druhý alikvotní podíl extraktu vzorku (0,5 ml) byl vložen do kazety HLB. Tento eluát byl shromážděn a přefiltrován přes 0,2mikronové polypropylenové membránové filtrační lahvičky.
Čištění vzorků pomocí ultrafiltrace
Ultrafiltrační zařízení bylo použito pro čištění extraktů vzorků, jako je pšenice, které měly po kroku centrifugace pevné částice. V této práci byly použity polyethersulfonové membrány s mezní molekulovou hmotností (MWCO) 3 kDa. Membrány byly předem připraveny průchodem 0,5 ml extrakčního rozpouštědla odstřeďováním při 4000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut, aby se udržel stálý retenční čas glyfosátu. Toto průchozí rozpouštědlo bylo zlikvidováno a byl načten 1 ml extraktu vzorku. Ultrafiltrační krok byl proveden odstřeďováním po dobu 45 minut při 4000 otáčkách za minutu. Bylo také zjištěno, že ultrafiltrační zařízení obsahující regenerovanou celulózovou membránu, jako jsou centrifugační filtry Amicon™ Ultra s MWCO 3 kDa, lze v tomto kroku použít bez předkondicionování. Čirý vzorek, který prošel membránou, byl odebrán a analyzován. K analýze byly použity nízkoabsorpční lahvičky, aby se zabránilo ztrátě analytů na povrchu skla.
Příprava vzorků piva
Stejnou metodikou bylo možné analyzovat vzorky piva. Nejprve bylo provedeno důkladné odplynění piva vložením vzorku piva na 15 minut do ultrazvukové lázně. Poté bylo 5 ml vzorku piva smícháno s 5 ml methanolu s 1% kyselinou mravenčí a vnitřním standardem. Tento vzorek byl krátce promíchán a vyčištěn postupem SPE.
LC/MS/MS metoda
Kolemna HPLC použitá pro tuto analýzu byla polymerní kolona apHera™ NH2 která poskytuje stabilní a robustní LC separace v rozsahu pH 2 až 13. Kolona HPLC byla použita v rozsahu pH 2 až 13. Kolona HPLC byla vyrobena z polymeru apHera™ NH2. Gradient mobilní fáze využíval vodu a uhličitan amonný při pH 9. Tato mobilní fáze zajistila správnou ionizaci glyfosátu, který má ve své struktuře fosfátovou skupinu, s detekcí za negativních podmínek ESI. Kromě toho je pufr uhličitanu amonného těkavý a je plně kompatibilní s LC/MS instrumentací. Tabulka 1 uvádí podmínky MS pro všechny analyty a Obrázek 2 představuje chromatogram standardního nástřiku. Analýza byla provedena pomocí přístroje AB Sciex QTrap 3200. Tím byla omezena citlivost metody. Jak je však vidět níže, metoda byla schopna kvantifikovat kontaminaci glyfosátem ve většině vzorků v této studii.
Výsledky
Výkonnost metody
Obě metody čištění SPE a ultrafiltrace poskytly dobré čištění vzorku a byly přijatelné pro analýzu LC/MS. V ovesných vločkách byly všechny tři analyty detekovány a kvantifikovány na úrovni 100 ppb. V pšeničné mouce byly glyfosát a glufosinát kvantifikovány na úrovni 100 ppb. Výsledky testů metod jsou uvedeny v tabulce 2. Metoda pro vzorky pšenice poskytla mírně vyšší nejistoty, až 19 % RSD. Při metodě pro pšenici nebylo použito čištění pomocí SPE a bylo zjištěno, že výsledné signály mají vyšší potlačení iontů ve srovnání se vzorky, které byly čištěny pomocí SPE, např. oves. Obecně se u všech vzorků vyskytovaly různé stupně potlačení iontů, od 50 % do 80 %, a proto bylo pro přesnou kvantifikaci důležité použít vnitřní standardy.
Obrázek 2.LC/MC analýza glyfostátu, AMPA a glufosinátu na apHera NH2
Glyfosát v pivu
V testovaném pivu nebyly nalezeny žádné analyty. Vzorek piva byl tedy obohacen o glyfosát a glufosinát v koncentraci 50 ppb a analyzován. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. V této práci jsme se o další screening piva nepokoušeli.
Identifikace a kvantifikace glyfosátu v obilovinách
Výsledky kvantifikace glyfosátu v obilovinách jsou uvedeny v Tabulce 3. Vzorky instantních ovesných vloček (obrázek 3) a bílé mouky obsahovaly významné množství glyfosátu, a to 1,2 a 0,8 ppm. Vzorek ovesných vloček z ekologického zemědělství neobsahoval detekovatelné množství glyfosátu (obrázek 4). Kojenecké rýžové cereálie obsahovaly velmi nízké množství glyfosátu. Jejich hladiny se blížily hranici citlivosti přístroje v této matrici a výsledná RSD byla vysoká. Kojenecké ovesné vločky obsahovaly glyfosát v množství 1,1 ppm a kojenecké smíšené vločky obsahovaly glyfosát v množství 0,25 ppm. Žádná z kojeneckých obilovin nebyla označena jako ekologická. Glufosinát nebyl nalezen v žádném obilném výrobku. AMPA byl nalezen pouze v instantních ovesných vločkách v nízkém množství.
Obrázek 3. Glyfosát-instant
Obrázek 4.Vzorek organické ovesné mouky, slepý vzorek a vzorek s příměsí glyfosátu 100 pb
Závěry
Navržená metoda vyvinutá pro glyfosát a příbuzné sloučeniny využívá detekci LC/MS/MS a iontově výměnnou polymerní kolonu apHera NH2 která je stabilní při vyšším pH. Metodika přípravy vzorků byla vyvinuta pro extrakci glyfosátu z obilných potravin. Metodika zahrnovala čištění pomocí polymerní SPE, které bylo úspěšně aplikováno na vzorky obilovin včetně ovesných vloček a výrobků z dětských cereálií. Pro výrobky obsahující pšenici bylo vyvinuto čištění zahrnující ultrafiltraci, které bylo úspěšně aplikováno na vzorky pšeničné mouky. Použití izotopicky značených standardů vedlo k vyšší přesnosti stanovení glyfosátu a umožnilo použití kalibračních křivek na bázi rozpouštědel díky kompenzaci ionizačních efektů přítomných ve vzorcích. Metoda se ukázala jako robustní a fungovala dobře i při použití starších a méně citlivých přístrojů.