Szabványos PCR-eljárás

Hogyan kell elvégezni a PCR-t

A standard polimeráz láncreakció (PCR) négy lépésből áll:

1. Adjuk hozzá a szükséges reagenseket vagy a mastermixet és a templátot a PCR-csövekbe.
2. Keverjük össze és centrifugáljuk.
   *Adjunk hozzá ásványi olajat, hogy megakadályozzuk a párolgást olyan termociklusban, amelynek nincs fűtött fedele.
3. Amplifikáljuk a termociklus-készülék és a primerek paramétereinek megfelelően.
4. A felerősített DNS-t agaróz gélelektroforézissel, majd etidium-bromid-festéssel értékeljük.

Ezeket a lépéseket az alábbiakban részletesebben ismertetjük, az anyagok és reagensek kiválasztásához kapcsolódó tippekkel együtt. Ez egy Taq DNS-polimerázt alkalmazó alapvető PCR-eljárás.

A PCR lépései és alapvető összetevői

A PCR-reakcióval kapcsolatos problémák elhárításában számos tényező játszik szerepet. Nézze meg ezt az animációt, és tudjon meg többet arról, hogyan segíthet az igényeinek megfelelő komponensek és ciklusfeltételek kiválasztása az optimális eredmények elérésében.

További protokollokat más polimerázokhoz vagy fejlett PCR-technikákhoz a „PCR-technológiák útmutató” „Protokollok” című szakaszában talál.

A standard PCR-ről, beleértve annak fogalmát is, bővebben a PCR alapjai oldalon olvashat.

Reagensek: Mire van szükség a PCR-hez?

Mi az a Taq-polimeráz?

A Taq DNS-polimeráz egy hőstabil enzim, amelyet a Thermus aquaticus nevű termofil baktériumból nyernek. Általában DNS-fragmentumok amplifikálására használják a PCR-ben. Az enzim rekombináns formában, E. coli-ban expresszálva áll rendelkezésre. Képes ellenállni a 95 °C-ra történő ismételt hevítésnek (amire a PCR-technika megköveteli) anélkül, hogy aktivitása jelentősen csökkenne. Az enzim molekulatömege SDS-PAGE-vel meghatározva körülbelül 94 kDa, és nem mutatható ki benne endonukleáz- vagy exonukleáz-aktivitás. 5'→3' DNS-polimeráz-aktivitással és 5'→3' exonukleáz-aktivitással rendelkezik. A Taq DNS-polimeráz minden tételét PCR-amplifikációval és kettős szálú szekvenálással tesztelik. Az enzimet 5 egység/µL koncentrációban szállítják, és optimalizált 10x reakciópufferrel együtt kapható.

Standard Taq DNS-polimeráz

Az alábbi táblázat segítségével válassza ki a reakciós feltételeinek megfelelő Taq DNS-polimeráz keveréket. Választhat tiszta vagy vörösre színezett készítmények közül, magnézium-kloriddal (MgCl₂) vagy anélkül, illetve előre elkészített készkeverékek vagy master mixek közül, amelyek puffert és dNTP-ket tartalmaznak.

Egység meghatározása: Egy egység 30 perc alatt, 74 °C-on 10 nmol teljes dezoxiribonukleozid-trifoszfátot épít be savval kicsapható DNS-be.

Eljárás: A PCR lépései

A Taq DNS-polimeráz, a sablon-DNS, a primerek és a MgCl2 koncentrációjának optimális feltételei a használt rendszertől függenek. Előfordulhat, hogy az egyes komponensek esetében külön kell meghatározni az optimális feltételeket. Ez különösen igaz a Taq DNS-polimerázra, a ciklusparaméterekre és a MgCl2-koncentrációra. Az optimális hatékonyság meghatározása érdekében ajánlott az enzim és a MgCl2 titrálása.

1. Adagolja a reagenseket egy megfelelő méretű csőbe a táblázatban megadott sorrendben. (Válassza ki a reakció beállításához megfelelő táblázatot: standard vagy készre kevert reagens.) Nagy számú reakció esetén készítsen elő egy sablon nélküli mastermixet, és osztja azt egyenlő mennyiségű részre a reakciócsövekbe. Végül adagolja a sablont a megfelelő csövekbe.
   

Standard PCR-reakció

*A puffert és a Taq-polimerázt együtt vásárolja meg: D1806, D4309 vagy D4545

Készre kevert PCR-reakció

2. Vortex segítségével óvatosan keverjük össze, majd rövid ideig centrifugáljuk, hogy az összes komponens a cső aljára ülepedjen.

Megjegyzés: Ha fűtött fedél nélküli termikus ciklálót használ, adjon 50 µL ásványi olajat minden cső tetejére a párolgás megakadályozása érdekében.

3. Végezze el az amplifikációt. Az amplifikációs paraméterek a primerektől és a használt termociklus-készüléktől függően változnak. Előfordulhat, hogy a rendszert az egyes primerekhez, a sablonhoz és a termociklus-készülékhez külön-külön kell optimalizálni.

Jellemző cikluszám

25–30 amplifikációs ciklus ajánlott.

4. Az amplifikált DNS agarózgél-elektroforézissel, majd etidium-bromid-festéssel értékelhető.

      Megjegyzés: Az ásványi olajréteg egyetlen kloroformos extrakcióval (1:1) eltávolítható, így visszanyerhető a vizes fázis.

Reagensek a nukleinsav-elektroforézishez

• Agaróz (előre öntött gélek, por stb.)
• Puffer, például MOPS-EDTA-nátrium-acetát, trisz-acetát-EDTA (TAE) vagy trisz-borát-EDTA (TBE)
• Gélbetöltő oldat és mintabetöltő puffer RNS-hez
• Elektroforézis-festék vagy színezőanyag, például etidium-bromid

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

A címke licencnyilatkozata

FIGYELMEZTETÉS A VÁSÁRLÓ SZÁMÁRA: LICENC-KIZÁRÁS

A termék megvásárlásával nem jár licenc az 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5 723 591, 5 876 930, 6 030 787 és 6 258 569 számú amerikai szabadalmak, valamint az Egyesült Államokon kívüli megfelelő szabadalmak, illetve az 5’-nukleáz és a kettős szálú DNS-hez kötődő festék eljárásokkal kapcsolatos bármely más szabadalom vagy szabadalmi bejelentés alapján. További információkért forduljon az Applied Biosystems licencigazgatójához, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA